CE20 - Biologie des animaux, des organismes photosynthétiques et des microorganismes

Régulation génétique et épigénétique du cycle de vie de l'algue brune Ectocarpus – Epicycle

Régulation génétique et épigénétique du cycle de vie de l'algue brune Ectocarpus

Le projet combine une caractérisation moléculaire détaillée des processus de régulation du cycle de vie avec des analyses à l'échelle du génome des changements dans l'expression des gènes et des modifications de la chromatine pour fournir une vue complète des événements associés à l'alternance des générations du cycle de vie l'algue brune Ectocarpus.

Élucider les processus génétiques et épigénétiques associés à la progression du cycle de vie et au déploiement du programme de développement des sporophytes dans l'algue brune Ectocarpus.

L'objectif du projet Epicycle est d'élucider les processus génétiques et épigénétiques associés à la progression du cycle de vie et au déploiement du programme de développement des sporophytes dans l'algue brune modèle multicellulaire Ectocarpus. Le projet combine une caractérisation moléculaire détaillée des processus de régulation du cycle de vie avec des analyses à l'échelle du génome des changements dans l'expression des gènes et des modifications de la chromatine pour fournir une vue complète des événements associés à l'alternance des générations du cycle de vie de cette algue brune. Le projet se concentre particulièrement sur les rôles de deux régulateurs majeurs du cycle de vie récemment découverts, les facteurs de transcription homéodomaine de classe TALE (HD TF) OUROBOROS (ORO) et SAMSARA (SAM). En plus de lier ces régulateurs à des événements génétiques et épigénétiques liés au cycle de vie, le projet vise à explorer le rôle de ces protéines dans deux situations où le programme de développement des sporophytes est initié dans un contexte haploïde sans fusion des gamètes : le développement parthénogénétique des gamètes et hétéroblastie méiosporale. L'objectif à long terme est de comparer les résultats obtenus par Epicycle avec les informations émergentes pour d'autres systèmes modèles eucaryotes, en particulier au sein de la lignée verte, dans le but de comprendre les origines évolutives profondes des systèmes de régulation du cycle de vie.

• Analyse bioinformatique des histones et modificateurs d'histones : Blast, études bibliographiques, génomique comparative
• Identification des PTM d'histones : extraction d'histones, spectrométrie de masse, western blot
• Analyse à l'échelle du génome des PTM d'histones : ChIP-seq, MN-seq, FAIRE-seq, RNA-seq, analyses transcriptomiques bioinformatiques
• Identification des interacteurs ORO et SAM : Y2H, pull-downs in vitro
• Développement d'une méthode basée sur CRISPR-Cas9 pour générer des knock-outs de gènes : libération de gamètes, conception bioinformatique de complexes CRISPR-Cas9, test in vitro de complexes CRISPR-Cas9, délivrance biolistique de complexes CRISPR-Cas9, analyse phénotypique et génotypique de mutants putatifs
• Méthodologies générales : Culture d'Ectocarpus

Nous avons effectué une caractérisation approfondie des caractéristiques de la chromatine chez Ectocarpus qui comprenait : 1) une annotation détaillée des gènes codant à la fois les protéines histones et les modificateurs d'histones (c'est-à-dire les auteurs et les gommes des modifications post-traductionnelles ; PTM), 2) une spectrométrie de masse exhaustive et analyse par buvardage des PTM d'histone dans Ectocarpus (47 PTM différents identifiés) et 3) analyse ChIP-seq des distributions à l'échelle du génome de 11 PTM sélectionnés au cours du cycle de vie d'Ectocarpus. Les distributions des PTM à l'échelle du génome ont indiqué que la plupart des marques analysées ont des fonctions similaires chez les algues brunes à celles observées chez les animaux et/ou les plantes terrestres (ainsi que chez les micro-algues telles que la diatomée modèle Phaeodactylum tricornutum). Par exemple, H3K4me2, H3K4me3, H3K9ac, H3K14ac et H3K27ac étaient associés à des sites de début de transcription (TSS) de gènes actifs, H3K36me3 avec les corps de gènes de gènes transcrits et H4K20me3 avec des séquences répétées et des transposons. En revanche, H3K79me2 présentait une distribution très nouvelle, marquant de vastes régions du génome, couvrant souvent plusieurs unités de transcription, un modèle qui n'a été observé dans aucun autre organisme à ce jour. La comparaison des profils PTM des histones au cours des générations de gamétophytes et de sporophytes du cycle de vie a montré que les profils d'expression biaisés par génération étaient approximativement corrélés avec les changements de présence de PTM localisés au TSS.
Une avancée majeure par rapport à la tâche 1 a été le développement d'une méthode basée sur CRISPR-Cas9 pour générer des knock-outs de gènes. Un article décrivant la méthode a été publié et la technique est actuellement appliquée aux gènes liés au cycle de vie dans le contexte de la tâche 1, notamment le facteur de transcription bZIP Ec-08_005050.

1) Notre analyse complète des PTM d'histones dans l'algue brune modèle Ectocarpus (Bourdareau et al., 2021) a été la première étude à analyser les modifications des histones dans cette lignée. L'étude représentera donc une référence clé pour les études futures, fournissant à la fois des méthodologies essentielles (telles que la méthode ChIP-seq adaptée) et un inventaire de référence des PTM d'histones d'algues brunes. En plus d'aborder les questions liées au cycle de vie, cette étude a fourni plusieurs nouvelles informations sur la fonction de la chromatine chez les algues brunes.
2) Le développement d'une méthodologie basée sur CRISPR-Cas9 pour générer des knock-outs de gènes dans l'algue brune modèle Ectocarpus (Badis et al., 2021) représente également une avancée importante car, auparavant, aucune méthode n'existait pour effectuer la génétique inverse chez l'algue brune . Ces algues sont un groupe écologiquement et économiquement important qui a développé indépendamment une multicellularité complexe, de sorte que ce nouvel outil devrait présenter un large intérêt.

• Bourdareau, S., Tirichine, L., Lombard, B., Loew, D., Wu, Y., Coelho, S.M. and Cock, J.M. (2021). Genome Biology, 22, 12.
• Badis, Y., Scornet, D., Harada, M., Caillard, C., Raphalen, M., Gachon, C.M.M., Coelho, S.M., Motomure, T., Nagasato, C. and Cock, J.M. (2021). New Phytologist, in press.
• Coelho, S.M., Cock, J.M. (2020). Annual Review of Genetics, 54, 71–92
• Coelho, S.M., Peters, A.F., Müller, D. and Cock, J.M. (2020). EvoDevo, 11, 19.
• Bringloe, T.T., Starko, S., Wade, R.M., Vieira, C., Kawai, H., De Clerck, O., Cock, J.M., Coelho, S.M., Destombe, C., Valero, M., Neiva, J., Pearson, G.A., Faugeron, S., Serrão, E.A. and Verbruggen, H. (2020). Critical Reviews in Plant Sciences, 39, 281-321.
• Jueterbock, A., Minne, A.J.P., Cock, J.M., Coleman, M.A., Wernberg, T., Scheschonk, L., Rautenberger, R., and Zhang, J. and Zi-Min (2021). Frontiers in Marine Science, 8, 658485.
• Yao, H., Scornet, D., Peters, A.F., Jam, M., Hervé, C., Potin, P., Coelho, S.M. and Cock, J.M. (2020). Bio-protocol, 10, e3753
• Zhao X, Rastogi A, Deton Cabanillas AF, Ait Mohamed O, Cantrel C, Lombard B, Murik O, Genovesio A, Bowler C, Bouyer D, Loew D, Lin X, Veluchamy A, Vieira FRJ, Tirichine L. (2021) New Phytol. 229, 3208-3220.
• Hoguin A, Rastogi A, Bowler C, Tirichine L. (2021) Scientific Reports, 11, 2954.
• Xue Zhao, Anne Flore Deton Cabanillas, Alaguraj Veluchamy, Chris Bowler, Fabio Rocha Jimenez Vieira and Leila Tirichine (2020). Frontiers in Marine Science, 7, 189.

Il est crucial que les processus qui initient le développement chez les organismes multicellulaires soient mis en place au moment approprié du cycle de vie. Toutefois les mécanismes moléculaires qui coordonnent ces deux processus (développement et cycle de vie) restent très mal caractérisés. Il est fort probable que la régulation épigénétique joue un rôle important dans la coordination de ces processus, permettant ainsi aux composants génétiques adéquats d'être exprimés à chaque stade du cycle de vie.

Nous avons montré que les gènes OUROBOROS (ORO) and SAMSARA (SAM) codent pour un régulateur majeur qui lie le cycle de vie aux processus de développement multicellulaire chez l'algue brune Ectocarpus. ORO et SAM codent pour deux facteurs de transcription homéodomaine de type TALE ("three amino acid loop extension"). La ressemblance entre ce système et des systèmes équivalents identifiés dans la lignée verte indique une origine commune probable extrêmement ancienne et donc l’importance fondamentale de cette voie de signalisation pour tous les eucaryotes. L'objective d'Epicycle est d'étudier les processus génétiques et épigénétiques associés avec la progression du cycle de vie chez Ectocarpus. Des approches destinées à disséquer la voie de signalisation ORO et SAM seront combinées à des analyses de modifications épigénétiques sur l'ensemble du génome (modifications post-traductionnelles des histones et TADs détectées avec Hi-C) pendant la progression du cycle de vie. La localisation subcellulaire d'ORO et SAM sera déterminée à différentes étapes du cycle de vie et leurs protéines d’interaction seront identifiées et caractérisées. Un large éventail d’approches comme le ChIP-nexus, DAP-seq, array de protéines et RNA-seq seront utilisées afin d'identifier à la fois les cibles directes d'ORO et SAM et les gènes effecteurs en aval de ceci. D'autres composants du système régulateur seront détectés par des cribles génétiques, dont un crible pour les mutations suppresseurs des phénotypes Oro- et Sam-. Ces données seront intégrées avec des informations sur les changements transcriptomiques et des variations des modifications de la chromatine sur l'ensemble du génome afin de fournir une vue compréhensive des évènements associés avec l'alternation des générations chez cette algue brune.

Le projet examinera aussi le rôle des gènes ORO et SAM dans deux situations ou le programme développemental du sporophyte est initié dans un contexte haploïde sans fusion de gamètes : développement parthénogénique des gamètes et heteroblastie meio-spore.

Epicycle associera deux partenaires très complémentaires. L'équipe de Roscoff travaille depuis longtemps sur la biologie des algues brunes et développe actuellement des approches génétiques et génomiques pour ce groupe d'organismes, notamment via le développement d'Ectocarpus comme organisme modèle et via le projet Phaeoexplorer (France Genomique) qui a généré les séquences génomiques de 45 espèces d’algues brunes. L'équipe Nantaise a une expérience conséquente dans le domaine de l'épigénétique et est pionnière dans l'application de ces techniques au stramenopiles (diatomées). La collaboration entre ces deux équipes dans le contexte d'Epicycle permettra la mise en œuvre d'une approche interdisciplinaire innovante afin d'avancer notre connaissance de la régulation et progression du cycle de vie, intégrant à la fois des facteurs génétiques et épigénétiques.

Les résultats obtenus par ces diverses analyses devraient permettre de comprendre comment les programmes de développement ont été liés aux processus sous-jacents du cycle de vie au cours de l'évolution. Plus généralement, ces informations devraient améliorer significativement notre compréhension de l’émergence de la multicellularité, une des questions majeures en évolution.

Coordination du projet

Mark COCK (Laboratoire de Biologie intégrative des modèles marins)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UFIP Unité de fonctionnalité et Ingénierie des Protéines
LBI2M Laboratoire de Biologie intégrative des modèles marins

Aide de l'ANR 531 029 euros
Début et durée du projet scientifique : janvier 2020 - 48 Mois

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