Suivi in vivo de la reprogrammation rhizobienne lors de la colonisation racinaire: de la rhizosphère à un mode de vie confiné dans la plante – Live-Switch

Live-Switch vise à répondre à la question inexplorée de savoir comment les rhizobia se reprogramment pendant le passage d'un environnement libre à un environnement hôte confiné, et comment cette reprogrammation est liée aux réponses spécifiques des plantes. En tirant parti des légumineuses modèles complémentaires, Medicago et Lotus, Live-Switch vise à suivre avec une résolution cellulaire la colonisation précoce des racines de l'hôte par des bactéries utilisant des voies d'entrée contrastées (transcellulaires ou intercellulaires). Grâce à l’utilisation de Medicago, infectée par la voie transcellulaire, le projet vise à aborder la dynamique spatio-temporelle des fusions de gènes ou de protéines bactériennes (liées à la signalisation, à la prolifération cellulaire et à la motilité) pendant la construction du cordon d’infection. A l’aide d'une méthode déjà établie dans l’équipe, où le système racinaire des plantes est cultivé sous un film plastique compatible avec des observations microscopiques répétées, des conditions ont été adaptés pour suivre in vivo les fusions fluorescentes bactériennes et végétales aux premiers stades de l'infection dans les poils racinaires. Ceci a nécessité l'ingénierie de gènes ou protéines bactériens (fusions d'intérêt) fusionnés à des protéines fluorescentes en combinaison avec une fusion contrôle de référence pour des études de co-dynamique, en conjonction ou non avec des marqueurs végétaux. Les fusions d'intérêt et la fusion contrôle de référence portent des protéines fluorescentes dont les spectres d'émission ne se chevauchent pas, ce qui permet la quantification relative du signal d'émission de la fluorescence des fusions d'intérêt par microscopie confocale. Ces observations sont réalisées à la fois dans des fonds WT et mutants, déficients pour l’infection, et sont complétées par des analyses de co-dynamique in vivo de fusions fluorescentes de plantes, afin de disséquer l'interaction plante-bactérie in vivo au sein des cordons d’infection. Pour mieux comprendre comment la motilité bactérienne est régulée au cours des premiers stades d’infection, nous analysons de manière complémentaire si des mutants bactériens de motilité sont affectés dans la colonisation de leur hôte et en parallèle exploitons les données in vivo générés dans le projet, pour construire un modèle mathématique intégré de la progression du rhizobia dans le compartiment d’infection in planta.
Live-Switch vise aussi à déterminer comment la reprogrammation bactérienne a lieu dans deux modes d'infection contrastés (intercellulaire vs transcellulaire) et réalise pour cela une étude comparative dans des espèces de Lotus établissant ces deux types d'infection. Nous avons adapté les conditions de croissance précédemment établies aux espèces de Lotus. Celles-ci sont utilisées pour disséquer la dynamique des fusions de gènes de Lotus, sélectionnés suite à des études transcriptomiques, au cours des modes d'infection transcellulaire et intercellulaire.

L'étude de la dynamique in vivo de fusions bactériennes d’intérêt dans la plante a nécessité la conception et l'ingénierie de constructions appropriées. Dans ce cadre, nous avons réussi à développer un nouveau système d'expression permettant l’expression à des niveaux natifs et la visualisation dynamique des fusions d’intérêt dans des cellules bactériennes uniques, aussi bien en dehors qu’à l’intérieur de la cellule végétale. Nous avons aussi pu établir des constructions de référence exprimant des protéines fluorescentes plus brillantes, offrant une sensibilité suffisante pour détecter les cellules bactériennes individuelles dans le cordon d'infection bien qu’exprimées en simple copie. Les analyses par co-imagerie des fusions fluorescentes et la protéine de référence ont validé l'adéquation de notre système pour suivre la progression des bactéries in planta et quantifier l'expression relative des fusions dans des bactéries à l'intérieur et à l'extérieur des cellules végétales. Dans ce cadre, des fusions d’intérêt liées à la production de signaux bactériens ou à la division cellulaire ont été générées et leur dynamique in vivo est en cours d’analyse dans des bactéries présentes dans la rhizosphère ou au sein du cordon. Du côté de la plante, en utilisant la fusion fluorescente ENOD11 associée à la paroi cellulaire, nous avons montré des changements transitoires dans l'interface de la paroi cellulaire pendant la maturation du cordon d'infection et ces changements sont affectés dans un contexte d’infection avortée. Des marqueurs bactériens précis semblent aussi s'accumuler de manière transitoire pendant la maturation du cordon d'infection, soulevant la question du lien fonctionnel avec des modifications du côté végétal.
Pour élucider la régulation du mouvement bactérien in planta, nous avons initié l’analyse phénotypique de mutants de motilité bactérienne et avons démontré que la motilité via des flagelles n’est pas essentielle pour la colonisation des racines de Medicago, bien qu'elle soit partiellement requise pour son efficacité. En parallèle, nous avons créé un modèle mathématique, sur la base des données d'imagerie in vivo, pour reproduire la progression du rhizobia dans le cordon. Cela a fourni des informations pertinentes sur la vitesse et le mouvement de la progression bactérienne dans ce compartiment.
Enfin, le système de microscopie confocale in vivo utilisé pour Medicago a été adapté aux espèces de Lotus pour l'imagerie des premiers stades de la colonisation des racines par des souches de rhizobia infectant leur hôte de manière transcellulaire (Mesorhizobium loti MAFF 303099) et intercellulaire (R. leguminosarum Norway). Nous avons généré des souches bactériennes fluorescentes et les avons utilisées pour étudier les premiers stades de la colonisation des racines ainsi que de rapporteurs GUS ou fluorescents pour les profils d'expression de gènes qui ont été sélectionnés sur la base des études transcriptomiques disponibles.

Maintenant que nous disposons d'un système expérimental fiable dans Medicago pour des analyses concomitantes d'imagerie de cellules vivantes de la plante et des partenaires symbiotiques bactériens, nous allons étudier plus en détail comment des fonctions bactériennes clés sont régulées pendant les premiers stades de l'infection des racines. Les questions spécifiques que nous voulons aborder sont liées à la compréhension de la façon dont la production de signaux symbiotiques est régulée dynamiquement pendant le développement du cordon d'infection, et la façon dont la motilité et la division des cellules bactériennes sont régulées dans le cordon. Ces analyses seront complétées par l'utilisation de mutants végétaux et de marqueurs spécifiques de plantes afin de mieux comprendre le dialogue croisé plante-bactérie. Enfin, les données d'imagerie in vivo qui seront générées devraient permettre d'affiner le modèle mathématique de la progression des rhizobia dans le cordon d'infection. En ce qui concerne le travail sur les espèces de Lotus, des lignées transgéniques stables exprimant des fusions promoteur-rapporteur de gènes marqueurs seront génotypées et caractérisées. Parallèlement, des fusions de rapporteurs sélectionnés seront introduites dans des souches de symbiotes de Lotus avec des modes d'infection intercellulaire ou transcellulaire, afin d'étudier l'expression des gènes rapporteurs bactériens aux sites d'infection de Lotus après inoculation des lignées transgéniques sélectionnées.

Communications (Conferences)
- 14th European Nitrogen Fixation Conference (Aarhus University, Denmark, virtual meeting) 2021. Impact of flagella loss during the early stages of infection in the Medicago truncatula/Sinorhizobium meliloti symbiotic interaction. Ambre Guillory, Anne Bennion, Anaïs Delers, Elizaveta Krol, Anke Becker, Joëlle Fournier and Fernanda de Carvalho-Niebel (poster and flash talk presentation by A. Guillory)
- 14th European Nitrogen Fixation Conference (Aarhus University, Denmark, virtual meeting) 2021. Signalling and cellular mechanisms in rhizobial plant cell entry. Fernanda de Carvalho-Niebel (plenary talk)
- 14th European Nitrogen Fixation Conference (Aarhus University, Denmark, virtual meeting) 2021. Dynamic cell wall modifications associated with early rhizobial infection thread development in Medicago truncatula. Joëlle Fournier, Killian Coutinho, Audrey Kelner, Marie-Christine Auriac, Lisa Frances and Fernanda de Carvalho-Niebel (poster presentation by J. Fournier)
- 14th European Nitrogen Fixation Conference (Aarhus University, Denmark, virtual meeting) 2021. Growth mode of alphaproteobacterial rhizobia generating cellular asymmetry. Elizaveta Krol, Lisa Stuckenschneider, Simon Schäper, Joana Kästle, Marcel Wagner, Heiko Wendt, Marcus Lechner, Peter L. Graumann, Anke Becker (talk by A. Becker)
- International Symposium for the 40th Anniversary of CIFN/CCG (2022) Multi-talent rhizobium - versatile adaptable symbiotic nitrogen fixer, SynBio chassis, and digital storage medium. Anke Becker (keynote by A. Becker)

Articles
-Dissecting plant cell priming mechanisms for endosymbiotic infection by rhizobia. Ambre Guillory*, Joëlle Fournier*, Audrey Kelner*, Lisa Frances, Marie-Christine Auriac, Martina Beck, Anaïs Delers and Fernanda de Carvalho-Niebel. In preparation.

Les légumineuses établissent des interactions fixatrices d'azote à bénéfice réciproque avec des rhizobia qui fournissent l'azote à la plante au sein d'organes racinaires spécialisés, appelés nodules. Les étapes précoces de cette interaction nécessitent des échanges moléculaires cruciaux dans la rhizosphère en amont de la reprogrammation de la plante hôte pour l'entrée racinaire des bactéries. Si la plupart des espèces de Rhizobia infectent les racines de leur hôte via de nouveaux compartiments d’infection apoplastiques formés dans les poils absorbants racinaires et appelés cordons d'infection, d'autres espèces utilisent des modes de colonisation alternatifs, intercellulaires qui ont été jusque-là assez peu étudiés. Dans les deux cas, les rhizobia doivent passer d'un mode de vie rhizosphérique à un mode infectieux, dans lequel elles se retrouvent confinées dans des compartiments apoplastiques végétaux. Jusqu'ici il a été techniquement difficile d'étudier comment les rhizobia se reprogramment dans ces espaces végétaux confinés durant les étapes précoces de colonisation, puisque ces évènements sont limités à un petit nombre de cellules racinaires. Live-Switch est un projet innovant qui a pour but d'étudier la question cruciale et inexplorée de la façon dont les rhizobia s'adaptent à la transition drastique d'un environnement rhizosphérique à un confinement à l'intérieur des tissus de l'hôte végétal. Basé sur les légumineuses modèle Medicago et Lotus, ce projet utilisera différents couples hôte-rhizobia établissant des infections intra- ou inter-cellulaires pour étudier à l'échelle cellulaire comment les rhizobia se reprogramment durant la transition entre vie libre et vie intra-hôte. Le projet combinera microscopie confocale in vivo et analyse de mutants aussi bien bactériens que végétaux pour disséquer les dynamiques de la production de signaux bactériens, de la croissance et de la motilité bactérienne ainsi que leur coordination avec le partenaire végétal. De plus, l'intégration des données dans un modèle mathématique permettra une meilleure compréhension de la dynamique de progression et de croissance des rhizobia dans les cordons d'infection in planta. Live-switch repose sur un cadre de collaboration intégrée idéal entre des groupes français et allemands dont les expertises solides et complémentaires en biologie moléculaire et cellulaire des partenaires végétaux et bactériens permettront d’aborder comment le changement dynamique d'environnement façonne la reprogrammation bactérienne pour la vie in planta.