Gynogenèse in vivo chez le maïs : nouvelles connaissances sur la double fécondation chez les plantes – NOT-LIKE-DAD

Dans ce projet, nous allons mettre en œuvre différentes stratégies afin de répondre à ces questions fondamentales de la reproduction des plantes. L'imagerie de la fécondation sera utilisée pour caractériser en détail les différentes étapes et évaluer les défauts lors d'une fécondation avec du pollen inducteur (mutant nld). L’évaluation de l’initiation, de l’étendue et de la spécificité de la fragmentation génomique sera réalisée pour étudier le devenir du génome paternel issu d'un pollen nld. La caractérisation biochimique de l’activité de NLD in vitro, couplée à des analyses de composition lipidique in vivo, fera la lumière sur l’identité des substrats/produits de cette phospholipase et sa fonction biologique. De plus, encouragés par nos données préliminaires sur l’identification de nouveaux acteurs moléculaires interagissant physiquement et/ou génétiquement avec NLD, nous allons les valider et en caractériser fonctionnellement les plus intéressants.

A ce stade, un premier résultat important de ce projet est la nouvelle localisation sub-cellulaire de la protéine NLD qui localise a l'extérieur des spermatozoïdes. En effet, contrairement aux études précédentes, nous avons démontré que la NLD ne localise pas dans le cytosol et la membrane plasmique des spermatozoïdes, mais une membrane spécifique qui dérive de la PM de la cellule végétative du pollen et qui entoure les deux spermatozoïdes: l'endo-PM. Nous avons démontré qu'un ancrage lipidique et des interactions électrostatiques sont nécessaire au bon adressage de NLD à l'endo-PM. L'utilisation de senseurs lipidiques nous a permis de décrypter la signature lipidique de cette endo-PM (https://doi.org/10.1083/jcb.202010077).

A ce stade, une étape importante du projet est désormais l'isolement et la caractérisation de nouveaux gènes impliqués dans l'induction haploïde. Les gènes candidats ont été sélectionnés et les mutants CRISPR ou les mutants d'insertion sont en cours d'obtention et seront analysés pendant le temps restant du projet.

1. Gilles LM, Calhau A, La Padula V, Jacquier NMA, Lionnet C, Martinant J-P, Rogowsky P, Widiez T. (2021)
Lipid anchoring and electrostatic interactions target NOT-LIKE-DAD to pollen endo-plasma membrane. Journal of Cell Biology, doi.org/10.1083/jcb.202010077

2. Jacquier NMA, Gilles LM, Pyott DE, Martinant JP, Rogowsky PM, Widiez T. (2020).
Puzzling out plant reproduction by haploid induction for innovations in plant breeding. Nature Plants, 6(6):610-619. doi.org/10.1038/s41477-020-0664-9

3. Seguí-Simarro JM, Jacquier NMA and Widiez T. (2021)
Overview of in vitro and in vivo doubled haploid technologies. Methods in Molecular Biology (Springer), doi.org/10.1007/978-1-0716-1315-3_1

4. Jacquier NMA, Gilles LM, Martinant JP, Rogowsky PM, and Widiez T. (2021)
The maize in planta haploid induction lines, a corner stone for doubled haploid technology. Methods in Molecular Biology (Springer), doi.org/10.1007/978-1-0716-1335-1_2

La reproduction sexuée représente un processus clé dans le succès évolutif des organismes eucaryotes. Chez les plantes à fleur, cette reproduction sexuée est caractérisée par un processus unique appelé double fécondation. Celui-ci implique la fusion séparée et simultanée de deux cellules spermatiques avec les deux gamètes femelles, cellule œuf et cellule centrale, donnant lieu à l'embryon et l'albumen nourricier, respectivement. Une lignée de maïs appelée «inductrice d’haploïde» présente une double fécondation altérée qui entraîne la production d’embryons haploïdes contenant uniquement les chromosomes maternels. Ce processus est appelé gynogenèse in vivo. Cette lignée inductrice d’haploïde est devenue l'outil privilégié pour de nombreux sélectionneurs de maïs, car elle est centrale dans le processus de production des plantes parfaitement homozygotes en seulement 2 générations au lieu de 5 à 8 dans les schémas de sélection classiques.


Plus de cinquante ans après la découverte de la première lignée inductrice, notre travail récent vient d'identifier le principal gène responsable de l'induction (Gilles et al., 2017, EMBO Journal; Gilles et al., 2017, Current Biology; Martinant et al., 2016, brevet : WO/2016/177887). Ce gène code pour une phospholipase de type A2, que nous avons appelée NOT LIKE DAD (NLD), car le génome paternel est absent des embryons haploïdes. En utilisant une combinaison de techniques génétiques, génomiques et cellulaires, nous avons montré qu’une phospholipase NLD intacte est nécessaire au niveau des cellules spermatiques pour le bon déroulement de la reproduction sexué. Ce projet ambitionne donc à résoudre le mystère selon lequel une protéine membranaire localisé au niveau des cellules spermatiques est nécessaire au maintien de l'intégrité du génome paternel dans les embryons. Nous aimerions comprendre: Comment la fonction biochimique de NLD est-elle liée à la transmission du génome paternel ; comment l'intégrité du génome paternel est maintenue au cours d'une double fécondation ; et comment la double fécondation est coordonnée ?


Dans ce projet, nous allons capitaliser sur nos récents résultats publiés et non publiés pour mettre en œuvre différentes stratégies afin de répondre à ces questions fondamentales de la reproduction des plantes. L'imagerie en temps réel de la fécondation, ainsi que des expériences de fécondation in vitro seront utilisés pour caractériser en détail les différentes étapes et évaluer les défauts lors d'une fécondation avec du pollen inducteur (mutant nld). L’évaluation de l’initiation, de l’étendue et de la spécificité de la fragmentation génomique sera réalisée pour étudier le devenir du génome paternel issu d'un pollen nld. La caractérisation biochimique de l’activité de NLD in vitro, couplée à des analyses de composition lipidique in vivo, fera la lumière sur l’identité des substrats/produits de cette phospholipase et sa fonction biologique. De plus, encouragés par nos données préliminaires sur l’identification de nouveaux acteurs moléculaires interagissant physiquement et/ou génétiquement avec NLD, nous allons les valider et en caractériser fonctionnellement les plus intéressants. L’ensemble de ces expériences complémentaires et indépendantes permettra de décrypter les mécanismes moléculaires sous-jacent à l’induction haploïdes, et apporteront au même temps des réponses sur la question fondamentale du déroulement et de la coordination de la double fécondation des plantes.