La tomographie par cohérence optique pour l'imagerie des organoïdes rétiniens – OREO

Setup: Un nouveau microscope multimodale (fluorescence, statique et dynamique FFOCT) sera développée pour la salle blanche à l'Institut de la Vision. Une excitation et une détection multi-longueurs d'onde sera développée, ainsi qu'une capacité d'acquisition dynamique en temps réel via un calcul rapide. Nous concevrons un boîtier pour contrôler l'environnement et utiliserons notre microscope dans des conditions propices au développement d'organoïdes. Nous prévoyons de concevoir une procédure permettant l'acquisition automatisée de piles d'images motorisées dans des plaques de culture transwell de format standard.
Quantification: Nous visons à afficher le signal FFOCT dynamique avec une échelle véritablement quantitative et à automatiser la classification des cellules. La validation par rapport aux données de vérité terrain identifiera les signatures FFOCT pour des types de cellules ou des comportements spécifiques. L'affichage quantitatif dans une échelle de couleurs HSV sera affiné en conséquence pour faciliter l'interprétation de la fréquence, de la bande passante et de l'amplitude de l'activité. Pour une différenciation non invasive des types de cellules et des comportements spécifiques identifiés, nous développerons et implémenterons des algorithmes de traitement du signal et d'apprentissage automatique.
Application: Un modèle organoïde rétinien 3D de RP (testant à la fois le RHO P347L muté de classe I et le RHO P23H muté de classe II) et son contrôle isogénique seront développés et suivis avec la configuration FFOCT installée. Le profil dégénératif sera analysé et caractérisé, et des solutions thérapeutiques seront testées sur ces modèles à base d'organoïdes dans l'espoir de détecter une récupération de la fonction cellulaire après la thérapie.

Validation du signal D-FFOCT: nous sommes en train de valider quelles organelles sont responsables du signal DFFOCT sur des cultures de cellules épithéliales rétiniennes en comparant les images DFFOCT et l'immunohistochimie sous condition de stress et sans stress, ainsi que sur les organoïdes rétiniennes en cours de développement. Une échelle de couleur quantitative a été développée pour pouvoir comparer les échantillons entre eux.
Microscope pour la salle de culture: le microscope DFFOCT destiné à la salle de culture est construit, complet et en phase de test à l’Institut Langevin. Nous avons amélioré le design initial pour optimiser son utilisation par le plus grand nombre dans une salle de culture, notamment en l’intégrant dans une base de microscope commercial (Olympus). Le montage sera déplacé à l’Institut de la Vision en été 2021 dans une nouvelle salle de culture consacrée.
Modèle de rétinite pigmentaire: Pour la validation du signal des organoïdes rétiniens (OR) ont été générés à partir de cellules souches induites à la pluripotence (iPS) humaines saines clone 5f (iPS-5f). Les âges des OR actuellement générés en flux tendu variant entre 28 jours (J28) et J42. Néanmoins, des OR plus vieux sont également générées (J150-200). L'analyse biochimique du profil dégénératif des OR mutés devrait débuter cet été (2021). L’objectif de démontrer de l’évidence d’action thérapeutique va démarrer en 2023.
Classification de cellules automatique: nous avons développé des algorithmes pour la classification automatique des cellules par deux méthodes différentes (par Feature engineering et par Convolutional neural networks). Ces algorithmes ont donné des résultats très prometteurs avec des précisions supérieures à 90%. Nous pourrons ensuite modifier ces algorithmes pour l’analyse automatique des organoïdes et la classification des cellules qui les composent.

Le développement du microscope et du modèle de maladie d'OREO vise à évoluer vers un nouveau développement thérapeutique, qui aura un impact sur la santé, et donc un impact sociétal et culturel, en contribuant à réduire la cécité.

En effet, la prévalence de la dégénérescence rétinienne, y compris la RP, serait de 1/3 000 à 1/5 000, ce qui représente un coût économique élevé en termes de soins. Une meilleure compréhension de la maladie et le développement thérapeutique pourraient avoir un impact important sur l'amélioration des soins et même la réduction de la prévalence. En ce qui concerne encore une fois l'impact économique, l'amélioration de l'efficacité du dépistage des médicaments conduira à un développement de médicaments plus rentable.

Dans un contexte plus large, la capacité de voir les processus biologiques en temps réel aura un impact scientifique en approfondissant la compréhension fondamentale de la dynamique subcellulaire dans la santé et la maladie.

Une éventuelle extension de la technologie à l'imagerie in vivo implique une imagerie clinique à faible coût de la thérapie in situ, permettant des essais cliniques rentables avec des mesures des résultats à court terme, c'est-à-dire la surveillance des changements cellulaires in vivo.

- Couturier A, Blot G, Vignaud L, Nanteau C, Slembrouck-Brec A, Fradot V, Acar N, Sahel JA, Tadayoni R, Thuret G, Sennlaub F, Roger JE, Goureau O, Guillonneau X, Reichman S. Reproducing diabetic retinopathy features using newly developed human induced-pluripotent stem cell-derived retinal Müller glial cells. Glia. 2021. PMID: 33683746.

- Slembrouk-Brec, Rodrigues A, Rabesandratana O, Gagliardi G, Nanteau C, Fouquet S, Thuret G, Reichman S, Orieux G, Goureau O. Reprogramming of Adult Retinal Müller Glial Cells into Human-Induced Pluripotent Stem Cells as an Efficient Source of Retinal Cells. Stem Cells Int. 2019. PMID: 31396286.

- Scholler, J., Groux, K., Goureau, O, Sahel JA, Fink M, Reichman S, Boccara A, Grieve K. Dynamic full-field optical coherence tomography: 3D live-imaging of retinal organoids. Light Sci Appl 9, 140 (2020). doi.org/10.1038/s41377-020-00375-8

- Scholler, J., Grieve, K., Thouvenin O., et al., Automatic diagnosis and biopsy classification with dynamic Full-Field OCT and machine learning, submitted to Nat. Medicine in march 2021

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) peuvent générer des organoïdes rétiniens 3D qui contiennent tous les principaux types de cellules rétiniennes et une stratification distincte proche de la morphologie in vivo. Ces organoïdes sont ainsi très prometteurs pour des fins de modélisation des maladies, ainsi que d'éventuelles stratégies de thérapie cellulaire chez les patients atteints de dégénérescence rétinienne. L’utilisation d’organoïdes est notamment envisagée pour faciliter la compréhension des mécanismes cellulaires conduisant à la rétinite pigmentaire (RP), un groupe de maladies neurodégénératives héréditaires qui entraînent la mort cellulaire sélective des photorécepteurs. Les mécanismes conduisant à la mort cellulaire restent inconnus et aucun traitement adéquat pour la RP n'est actuellement disponible. La dégénérescence rétinienne, et en particulier la RP, peut être ciblée via les méthodes de modélisation « maladie dans une boîte de Pétri ». L'idée est de créer un processus dégénératif qui ressemble à la RP, avec une apoptose progressive des photorécepteurs. Bien que des modèles de RP en 2D aient été proposés, un modèle de RP en 3D à base d'organoïdes serait plus proche de la réalité. Les médicaments peuvent ensuite être testés sur ce modèle de RP afin de contrôler leur efficacité et d'identifier des médicaments candidats potentiels pour des essais cliniques.

Des outils d'imagerie à haute résolution sont essentiels pour effectuer un contrôle non destructif de qualité sur ces cultures cellulaires 3D. À l’heure actuelle, le développement des organoïdes est assuré en cultivant une série d’échantillons, dont une partie est sacrifiée à chaque étape de contrôle. Le processus d’imagerie nécessite en effet de fixer, découper et effectuer de multiples procédures de marquage fluorescent sur les organoïdes afin de déterminer les nombreux types cellulaires présents, et le bon développement de la culture 3D. En rendant possible l'imagerie non destructive de ces échantillons, un seul organoïde pourrait être suivi au cours du temps, permettant ainsi une observation directe du développement et du comportement de chaque échantillon. Cependant, les techniques d'imagerie en temps réel utilisables en médecine régénérative sont actuellement limitées aux cultures 2D.

La tomographie par cohérence optique plein champ (FFOCT) est une approche non invasive à haute résolution de la tomographie par cohérence optique (OCT). La FFOCT, développée par les membres du groupe du projet, permet l’imagerie sans marquage des tissus oculaires avec une résolution micrométrique en trois dimensions. Nous avons récemment ajouté un mécanisme de contraste complémentaire à la FFOCT pour accéder aux informations fonctionnelles. La FFOCT dynamique détecte le mouvement intracellulaire pour afficher un contraste basé sur le métabolisme cellulaire, indicateur de la viabilité cellulaire. De plus, notre technique peut combiner des voies de fluorescence et FFOCT en superposition pour permettre la localisation de cellules fluorescentes dans leur microenvironnement 3D.

Nous émettons alors l'hypothèse que nous serons capables de i) créer un modèle 3D de RP basé sur les organoïdes, et ii) détecter la dégénérescence et la récupération des photorécepteurs dans ce modèle, de manière non invasive et sans marquage, avec la FFOCT, reproduisant ainsi les informations quantitatives généralement disponibles uniquement par l'immunofluorescence.

Le projet multidisciplinaire OREO repoussera les limites de la pratique actuelle sur trois fronts - technologique, informatique et biologique - en développant un outil d'imagerie FFOCT multimodale à utiliser en salle blanche ; en développant des outils informatiques pour la quantification et la classification automatique des cellules ; et en développant un nouveau modèle 3D de RP et son contrôle isogénique qui seront suivis au fil du temps avec la FFOCT.