Ciblage de l'agression ischémique, application à la transplantation d'organes – KIRI

Tâche 1.1 : synthèse organique de la 5'-N-L-séryl-sulfamoyl adénosine (SFA)
Nous préparons divers analogues lors de la modification du lieur en utilisant des analogues de carbamate, d'ester et de triazole comme alternatives plus stables pour les dérivés SFA
Tâche 1.2 Activité biologique du SFA et des analogues synthétisés
Les inhibiteurs de serRS obtenus au cours de la tâche 1.1 sont criblés pour leur capacité à inhiber la traduction de la protéine rapporteur de la luciférase à l'aide d'un protocole de synthèse in vitro. Ce criblage donne une courbe d'inhibition dose-réponse. Le deuxième criblage est réalisé sur des cellules de culture rénale soumises à l'anoxie (mort cellulaire et mesure du stress oxydatif)
Tâche 1.3 Mesure des paramètres du métabolisme cellulaire
Parallèlement à la détermination de l'activité biologique des inhibiteurs nous vérifions les principales voies permettant la résistance à l'ischémie et la préservation de l'ATP dans notre modèle, comme l'inhibition de la synthèse des protéines, le profil bioénergétique ou le phénotype mitochondrial. La teneur en protéines cellulaires dans chaque condition expérimentale est quantifiée à l'aide d'un kit de dosage colorimétrique. La mesure de la teneur en ATP cellulaire est effectuée à l'aide d'un kit de dosage luciférine/luciférase. Les profils bioénergétiques sont établis à l'aide d'un flux extracellulaire Seahorse XF96.
Tâche 2.1 Synthèse chimique de nouveaux dérivés d'AFS
Afin d'augmenter l'affinité pour la cible ainsi que de maintenir la sélectivité des inhibiteurs initiaux SFA, nous concevons de nouveaux analogues qui incluent des modifications à la fois de la fraction séryle (chaîne latérale d'acides aminés) et de la nucléobase adénine. Tout d'abord, nous effectuons une étude d'amarrage moléculaire en utilisant la structure cristalline rapportée de serRS. Nous concevons de nouveaux inhibiteurs porteurs potentiellement d'une activité améliorée ainsi que de propriétés physico-chimiques favorables à une éventuelle application thérapeutique. Nous modifions la partie sérine et la partie nucléobase. La pureté des dérivés obtenus est évaluée par des méthodes analytiques classiques telles que l'analyse HPLC-MS et la caractérisation RMN.
Tâche 2.2 L'activité biologique des composés nouvellement synthétisés sera confirmée par l'étude de leurs activités sur la traduction des protéines in vitro et dans des cellules en culture soumises à l'anoxie. Cette tâche est similaire à la tâche 1.2 concernant les précédents inhibiteurs de la serRS.
Tâche 2.3 Application physiologique des dérivés de sérine les plus pertinents sur les lésions d'ischémie/reperfusion dans les reins de rat.
Les rats sont traités ou non avec les inhibiteurs (concentrations définies dans la tâche 2,2). Une ischémie de l'artère rénale (40 min) est réalisée et la fonction rénale est évaluée dans les 24 heures. Le biomarqueur précoce NGAL est mesuré avec les principales fonctions de transport tubulaire.

- Conformément au projet nous avons synthétisé le 5'-N-L-seryl-sulfamoyl adenosine (SFA) selon le protocole que nous avons mis au point

- Nous avons pu montrer que cet inhibiteur était capable d'inhiber la séryl tRNA synthétase en utilisant une technique de traduction in vitro à partir de réticulocytes de lapin et de la protéine rapportrice luciférase. Nous avons pu déterminer son IC50 in vitro qui se situe aux alentours de la micromole.


- Nous avons pu montrer que le SFA synthétisé possédait une action protectrice contre l'anoxie sur des cellules rénales en culture et sur des neurones en cultures primaires. Le concept d'inhibition de la serRS comme effet protecteur conte un épisode ischémique semble donc validé.


- La première partie du projet concerne également la synthèse de nouveaux analogues stables de la 5'-N-L-seryl-sulfamoyl adénosine par modification du lieur entre les fragments sérine et adénosine. Malheureusement, cette tâche a commencé plus tard que prévu en raison de la pandémie de SRAS-CoV-2 qui a empêché le partenaire 2 de recruter à temps l'ingénieur non permanent requis pour effectuer la synthèse. La préparation des nouveaux analogues a commencé il y a quelques mois seulement avec la synthèse de deux analogues de triazole. Ces composés n'ont jamais été décrits dans la littérature et nous avons dû mettre en place les conditions de chaque étape de leur synthèse chimique. La préparation de chaque composé nécessite 6 étapes. Les composés sont en cours de caractérisation et seront bientôt disponibles pour leur évaluation biologique.


5'-O-seryltriazolyladéonsine A 5'-O-seryltriazolyladéonsine B
analogues triazole du SFA en cours de synthèse.

- D'un point de vue biologique nous avons comme prévu analysé les effets de l'inhibition de la voie protection contre l'ischémie sur des paramètres métaboliques. Le mécanisme mis en évidence implique un changement métabolique de la phosphorylation oxydative vers la glycolyse permettant aux cellules rénales d'être transitoirement indépendantes de l'apport d'oxygène. Nous avons montré que le GC7 diminue l'expression des protéines du transporteur de glucose rénal GLUT1 conduisant à une diminution du flux de glucose trans-cellulaire. Dans le même temps, GC7 modifie la source d'énergie native des cellules proximales de la glutamine vers l'utilisation du glucose. Ainsi, le GC7 reprogramme de manière aiguë et réversible la fonction et le métabolisme des cellules rénales pour faire du glucose son unique substrat, permettant ainsi aux cellules d'être indépendantes de l'oxygène par glycolyse anaérobie. Les conséquences physiologiques sont une augmentation de l'excrétion rénale de glucose et de lactate traduisant une diminution de la réabsorption du glucose et une augmentation de la glycolyse.

Résultats remarquables:
- La protéine serRS est une cible pharmacologique contre l'ischémie rénale et neuronale
- L'inhibition de la voie eIF5A reprogramme le métabolisme rénal du glucose

L'originalité de ce projet dans les domaines de la biologie cellulaire, de la physiologie et de la clinique repose sur un nouveau paradigme qui dépasse les connaissances actuelles dans le domaine de l'ischémie et qui ouvre la voie à un nouveau champ d'investigation dans ce domaine. L'implication de serRS avec la voie moléculaire eIF5A était inattendue et la découverte d'inhibiteurs originaux et efficaces de serRS ouvrira la voie à une gestion pharmacologique précise de l'ischémie-reperfusion ainsi que des accidents vasculaires cérébraux pour lesquels et jusqu'à présent aucun médicament n'a été utilisé avec succès. en santé humaine. Nos deux brevets déposés successifs liés à la tolérance ischémique ont reconnu cette avancée (1 : WO2012010641 composition pharmaceutique pour augmenter la tolérance à l'hypoxie cellulaire. 2012 ; 2 : EP18176120 Modulateurs et compositions pharmaceutiques les comprenant pour augmenter la tolérance à l'hypoxie cellulaire. 2018).
Outre la découverte d'un tout nouveau couple cible/médicament validé utilisable dans les pathologies ischémiques humaines, ce travail vise à progresser dans la connaissance fondamentale du réseau cellulaire lié à l'ischémie et à l'hypoxie qui est actuellement mal compris. L'identification à l'avenir d'une nouvelle génération de cibles nécessite une compréhension approfondie des processus conduisant à la tolérance ischémique. L'objectif n'est pas seulement de valider le concept actuel dans des modèles animaux de pathologies humaines mais aussi les mécanismes contrôlant cette nouvelle voie qui pourraient être des opportunités thérapeutiques pour la prochaine génération de médicaments liés à la tolérance ischémique.

Inhibition of eIF5A hypusination reprogrammes metabolism and glucose handling in mouse kidney.
Cougnon M, Carcy R, Melis N, Rubera I, Duranton C, Dumas K, Tanti JF, Pons C, Soubeiran N, Shkreli M, Hauet T, Pellerin L, Giraud S, Blondeau N, Tauc M, Pisani DF.
Cell Death Dis. 2021 Mar 17;12(4):283. doi: 10.1038/s41419-021-03577-z.
Targeting oxidative stress, a crucial challenge in renal transplantation outcome.
Carcy R, Cougnon M, Poet M, Durandy M, Sicard A, Counillon L, Blondeau N, Hauet T, Tauc M, F Pisani D.
Free Radic Biol Med. 2021 Jun;169:258-270. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2021.04.023. Epub 2021 Apr 21.

Ce projet vise à concevoir une nouvelle génération d'inhibiteurs pharmacologiques capables de contrecarrer les conséquences d'un épisode ischémique. Ils ciblent une protéine que nous avons récemment identifiée et impliquée dans la résistance des organes à l'ischémie. L'application clinique est la transplantation rénale.
La prévention des conséquences d'un stress ischémique, du à une privation d'oxygène est une des préoccupations majeures des cliniciens. Ce stress intervient dans des situations pathologiques comme l'accident vasculaire cérébral, l'infarctus du myocarde, la chirurgie aortique ou lors de la transplantation d'organes. Dans ce dernier cas le stress ischémique est programmé par le clinicien qui peut donc appliquer des protocoles de pré-conditionnement aptes à préparer l'organe à résister contre ce stress. Malheureusement les praticiens sont en manque de traitement contre ces pathologies ischémiques en raison de l'absence de cibles pharmacologiques identifiées. Une étude menée par Vigne et col. (2008) a ouvert un nouveau champ d'investigation en mettant en évidence chez la drosophile un nouveau paradigme dans la tolérance à l'hypoxie. Ces auteurs ont montré le rôle primordial des polyamines dans la sensibilité à l'oxygène et ils ont identifié le facteur de traduction eIF5A (eukaryotic initiation factor 5A) et plus particulièrement son étape d'activation comme étant une cible pharmacologique de la tolérance ischémique. Nous avons transposé ce nouveau concept chez le mammifère et avons montré que l'inhibition de l'activation de eIF5A par le GC7 (N-guanyl-1,7-diaminoheptane) protége la fonction rénale d'un stress ischémique induit par une occlusion temporaire de l'artère rénale via une diminution de l'activité de la phosphorylation oxydative associée à une baisse du stress oxydatf. Cette méthode pharmacologique d'augmentation de la tolérance ischémique ciblant l'hypusination de eIF5A a été protégée par un brevet international (WO/2012/010641). Appliquée à la transplantation rénale au niveau pré-clinique chez le cochon nous avons montré que le pré-conditionnement du donneur avec le GC7 permet une très nette amélioration de la reprise de la fonction rénale du receveur. eIF5A est un élément important de la traduction protéique et contrôle la synthèse spécifique d'un certain nombre de protéines. Pour identifier la cible primaire impliquée dans la tolérance ischémique nous avons mené une étude protéomique différentielle associée à la spectrométrie de masse qui nous a permis d'identifier une protéine candidate dont nous tairons l'identité pour cause de dépôt de brevet en cours. L'inhibition génique de cette protéine par une technique siRNA ou par des inhibiteurs de faible affinité ont confirmé, in vitro et in vivo, son rôle dans la tolérance ischémique.
Notre but est de générer, par synthèse organique, des inhibiteurs de haute affinité pour cette cible protéique et, une fois caractérisés in vitro, de les utiliser in vivo dans un modèle préclinique de transplantation rénale chez le cochon pour in fine les tester en essais cliniques. Les premiers essais menés avec un inhibiteur spécifique utilisé pour des expériences de cristallographie de la cible ont donné des résultats positifs sur l'augmentation de la tolérance anoxique in vitro confirmant la pertinence du concept. Sur ce projet nous avons réuni un consortium de 3 laboratoires possédant les expertises complémentaires nécessaires. UMR7370 Nice, inventeur du concept, spécialiste en biologie cellulaire, physiologie rénale et gestion du stress oxydatif; UMR7272 Institut de Chimie de Nice spécialisé dans la synthèse organique de molécules actives; U1082 CHU de Poitiers, spécialiste en transplantation rénale à un niveau préclinique chez le cochon. Nous demandons à l'ANR un soutien de 500k€ pour les 3 équipes et pour 3 ans. A terme le développement de ce concept pourrait s'appliquer à tous les domaines pathologiques ou cliniques dans lesquels un stress ischémique est impliqué