Conception d'antimicrobiens actifs en milieu salin inspirée par la biodivesité marine. – MOSAR-DEF

Le projet a utilisé une large combinaison de méthodes alliant la chimie de synthèse, la biologie structurale, le séquençage nouvelle génération, la biologie cellulaire, la microbiologie, la mutagénèse, et la microscopie à super résolution.

- La chimie de synthèse a permis d’obtenir des quantités suffisantes de chaque big-défensine (plusieurs dizaines de milligrammes). Elle a aussi permis de générer des big-défensines modulaires, greffables par des fluorophores grâce à la chimie click.

- La biologie structurale a permis d’établir la structure tri-dimensionnelle des différentes big-défensines et d’identifier les acides aminés potentiellement impliqués dans la reconnaissance des bactéries.

- Le séquençage nouvelle génération (barcoding 16S) a été employé pour montrer in vivo le rôle des big-défensines dans le façonnage du microbiote de leurs hôtes mollusques. Le séquençage sur cellules uniques (single-cell sequencing) a été employé en complément de la biologie cellulaire pour identifier les cellules immunitaires productrices des big-défensines chez leurs hôtes mollusques.

- La microbiologie a été employée pour identifier les bactéries sensibles aux big-défensines et caractériser leur mécanisme d’action, et tester la capacité des bactéries à développer des formes de résistance.

- La mutagénèse a été appliquée pour l’obtention de mutants bactériens afin de tester les cibles moléculaires des big-défensines sur leurs bactéries cibles.

- Des souches bactériennes provenant de patient atteints de mucoviscidoses ont également été testées.

- La microscopie à super résolution a été employée pour identifier les cibles cellulaires/moléculaires des big-défensines chez les bactéries.

La diversité structurale des big-défensines : un atout pour mieux protéger leur hôte. Les big-défensines sont actives sur un large éventail de bactéries appartenant au microbiote de leurs hôtes naturels, les huîtres. Leur grande diversité de structures leur permet d’élargir leur spectre d’activité antimicrobienne et leur confère des synergies laissant supposer qu’une telle diversification structurale a pu apparaitre chez ces organismes filtreurs (les huitres se nourrissent et respirent en filtrant l’eau de mer) confrontés en permanence à une grande diversité de bactéries du milieu marin. Le séquençage du microbiote des huîtres a permis de montrer que les big-défensines contrôlent finement les populations bactériennes des tissus des huîtres. A l’échelle cellulaire, les cellules immunitaires produisant les big-défensines 1 et 2 sont surtout les hyalinocytes.

Mécanisme d’action : cibler la paroi des bactéries et les agréger. L’étude fine des interactions entre la big-défensine 1 et les bactéries Staphylococcus aureus a révélé que la paroi bactérienne était la cible de la big-défensine 1, qui dès lors s’auto-assemble et emprisonne les bactéries dans d’épais réseaux de big-defensine appelés « nanonets ». Les bactéries y sont tuées par un mécanisme encore peu compris. La reconnaissance de la paroi passe par le domaine N-terminal de la big-défensine. Parmi les cibles moléculaires de la big-défensine, les acides teichoiques jouent un rôle majeur. L’absence de ces composants majeurs de la paroi rend les bactéries résistantes. Les deux domaines, N- et C-terminaux de la big-défensine 1 agissent en synergie pour tuer les bactéries. Le domaine C-terminal, qui ressemble aux défensines β des animaux vertébrés est transporté tel un cargo par le domaine N-terminal, afin de se rapprocher de la bactérie. Ce domaine N-terminal est aussi essentiel à la formation des nanonets. Spécifique aux big-défensines, nous pensons qu’il a été maintenu chez les huîtres sous l’effet de leurs concentrations salines élevées.

Potentiel thérapeutique : des activités sur les bactéries résistantes mais une stabilité assez faible dans les fluides biologiques. Les big-défensines sont actives sur bactéries multirésistantes aux antibiotiques, notamment des souches de S. aureus MRSA isolées de patients à atteints de mucoviscidose. Cette activité est stable à concentrations salines élevées (jusqu’à 400 mM NaCl) ce qui permet d’envisager une utilisation dans des traitements alliant administration d’antimicrobiens et de sels par nébulisation. Par ailleurs ces molécules n’ont révélé aucune activité pro-inflammatoire. Malheureusement leur stabilité s’est révélée assez faible (< 2 h) dans les fluides biologiques, notamment les expectorations pulmonaires. Enfin, en évolution expérimentale, nous avons pu observer que S. aureus était capable de s’adapter et qu’au bout d’une dizaine de générations, il devenait moins sensible à la big-défensine utilisée en mono-traitement in vitro.

Si nos travaux ne permettent pas à ce jour de proposer les big-défensines comme un traitement antibiotique plausible pour le traitement des infections par S. aureus, ils permettent d’ouvrir un certain nombre de pistes inspirées de l’étude des molécules remarquables :

- Cibler la paroi et piéger les bactéries : Le domaine N-terminal des big-défensines a été perdu chez la quasi-totalité des espèces qui ne vivent pas en milieu salin. Ainsi, les défensines humaines jouent divers rôles immunitaires mais ne fonctionnent plus en tant qu’antimicrobien aux concentrations salines retrouvées dans le sérum humain (150 mM). Nos travaux ont permis de montrer que ce domaine ancestral a des propriétés remarquables : il permet l’adressage à la paroi et la formation de réseaux moléculaires qui emprisonnent les bactéries indépendamment de la concentration en sel. Nous pensons qu’il pourrait être intéressant d’explorer son rôle dans le transport d’antibiotiques ou de peptides antimicrobiens vers la paroi bactérienne, afin d’améliorer voire de restaurer leur activité. Cela demandera d’explorer davantage les interactions directes et indirectes de ce domaine avec les acides teichoiques, composants essentiels de la paroi des bactéries à Gram positif que nous avons identifiés comme des cibles potentielles pour ce domaine.

- Les cocktails d’antimicrobiens : Si nous manquons de nouveaux antibiotiques pour le traitement des infections, il serait aujourd’hui assez peu responsable de proposer de nouveaux traitements qui génèreraient de la résistance à une vitesse comparable à celle des antibiotiques actuels. Or, la big-défensine 1 a montré qu’elle pouvait induire de la résistance lorsqu’elle est utilisée seule. Il sera donc important de comparer la vitesse d’apparition de cette résistance par rapport aux antibiotiques actuels. Par ailleurs, il faudra s’inspirer encore davantage de la nature : chez les huîtres, les big-défensines agissent sous forme de cocktails de molécules diverses. Il faudra donc tester d’abord in vitro si l’administration de cocktails de big-défensines ralentit l’apparition des résistances. On pourra aussi tester in vitro l’administration de big-défensines en cocktail avec d’autres antimicrobiens, tels que des antibiotiques. Enfin, il sera possible de tester l’effet des big-défensines in vivo, où elles agiront en cocktail avec les peptides antimicrobiens des souris, ce qui pourrait naturellement réduire l’émergence de résistances.

Le développement préclinique de peptides antimicrobiens cationiques comme alternative aux antibiotiques est ralenti par leur inactivation par les sels. S'inspirant de la biodiversité marine, le projet MOSAR-Def a pour objectif de transformer les défensines humaines sensibles au sel en défensines actives en milieu salé. Cet objectif ambitieux est atteignable grâce i) aux découvertes récentes de notre consortium sur la structure/activité des big-défensines, ancêtres marins des ß-defensines, ii) aux nouvelles méthodologies en ligation chimique et ingénierie, et iii) à l'équipe multidisciplinaire du consortium MOSAR-DEF, réunissant des chimistes des peptides, des structuralistes, des microbiologistes (spécialistes des microorganismes marins et pathogènes de l’Homme), des biochimistes. Le projet contribuera à l'acquisition de nouvelles connaissances sur les défensines actives à des concentrations (physio)pathologiques en sels et un pas vers une alternative aux antibiotiques classiques.