Conséquences du dysfonctionnement du rythme circadien lié à l’âge sur les défenses immunitaires innées contre les infections respiratoires – DREAM

Des méthodes classiques seront utilisées tells que cytométrie en flux, RNAseq, RT-PCR et des tests immunologiques fonctionnels. Pour étudier le role de la sénescence cellulaire sur l’altération du rhythme circadien, un modèle unique de souris transgénique (p16-ATTAK) permettant d’éliminer les cellules sénescentes sera utilisé (souris âgées). Dans une perspective translationnelle, l’expression des gènes de l’horloge (dont Rev-erba), des marqueurs de sénescence et des gènes cibles de Rev-erb? sera analysée au sein de poumons humains de sujets âgées (lobectomie pulmonaire). Pour étudier le role de Rev-erba dans l’immunité antibactérienne pulmonaire, une approche génétique par délétion du gène et l’utilisation d’agonistes spécifiques régulant l’activité de Rev-erba seront développées. Les cellules épithéliales et les cellules myéloïdes sont importantes dans la régulation du rhythme circadien et dans le contrôle de l’inflammation pulmonaire. Nous déléterons sélectivement le gène Rev-erba au sein de ces cellules. Les signatures moléculaires et cellulaires (nombre, fonctions) seront identifiées chez les souris jeunes infectées ou non par Streptococcus pneumoniae.

Nous avons analysé la charge bactérienne des souris jeunes infectées à 4 temps différents de la journée. Les souris jeunes sont plus sensibles à l’infection au cours des phases de repos (ZT6/ZT12). Cette régulation circadienne est moins marquée chez les souris âgées, plus sensibles à l’infection que les souris jeunes. Par ailleurs ces dernières sont légèrement plus résistantes à l’infection à ZT12. Ainsi, l’âge influence la régulation circadienne des mécanismes de défense dans les poumons. L’analyse des données transcriptomiques révèle que la rythmicité de l’expression de Rev-erba est altérée chez les souris âgées. La rythmicité de l’expression de l’apeline (Apln) et son récepteur APJ, est aussi altérée dans les poumons des souris âgées; résultats confirmés par RT-qPCR. Par ailleurs, l’expression de Apln/APJ est anti-phasique par rapport à Rev-erba. Connaissant le rôle de répresseur transcriptionnel de Rev-erba, cela pourrait suggérer une interconnexion entre Rev-erba et la régulation circadienne de la voie Apélinergique. Le rôle potentiel de l’axe Apélinergique (Apln/APJ) dans le cadre d’une infection respiratoire n’a pas encore été étudié. Nos expériences montrent que le traitement des souris avec l’apeline induit une protection contre l’infection par S. pneumoniae. Ainsi, Apln/APJ jouerait un rôle bénéfique et Rev-erba un rôle délétère dans la réponse antibactérienne. Par ailleurs, nous avons montré (Chip-PCR) que RevErba contrôle - de façon circadienne - l’expression de Apln et APJ. L’analyse de l’expression des gènes de l’horloge (6 ZTs analysés) montre des résultats sensiblement différents par rapport à ceux initialement obtenus (2 ZTs analysés). Il semble en fait que les gènes de l’horloge (dont Rev-erba) sont toujours régulés de façon circadienne chez les souris âgées mais avec une amplitude beaucoup moins marquée. Par contre, l’expression de Apln et APJ n’est plus régulée de façon circadienne chez les souris âgées. Une analyse globale en RNA-seq sera menée prochainement.

Les priorités du programme DREAM pour les mois qui viennent sont les suivantes. Nous souhaitons (1) mieux comprendre les mécanismes par lesquels Rev-Erba inhibe les défenses antibactériennes et (2) manipuler l’activité de Rev-erba à l’aide d’agonistes et antagonistes afin de moduler les mécanismes de défense antibactérienne pulmonaire (souris jeunes/souris âgées). A la vue de nos résultats récents, nous poursuivrons l’étude de l’interaction Rev-Erbs-Apln/APJ. L’utilisation de l’Apln pourrait aussi restaurer les mécanismes de défense chez les souris âgées. Le lien sénescence cellulaire et l’expression circadienne de Rev-Erbs sera étudié. L’utilisation de sénolytiques pourrait restaurer l’amplitude du rythme circadien. L’analyse chez l’homme est toujours programmée.

Brevet PCT/ EP20305739.3. (01 July 2020) “Method and composition for a subject suffering from altered circadian rythm”. Inventeurs: Duez H, Joseph C, Pourcet B, Trottein F

La pneumonie bactérienne fait partie des premières causes de mortalité chez le sujet âgé. Considérant le vieillissement de la population, il est important de mieux comprendre les causes conduisant aux pneumonies bactériennes afin de mettre en place des stratégies thérapeutiques innovantes. L’horloge circadienne intervient dans de nombreux processus physiologiques, métaboliques et immunologiques. A titre d’exemple, l’expression des gènes de l’horloge au sein des cellules immunitaires contrôle l’intensité des réponses immunes et inflammatoire au cours de l’infection. Chez les personnes âgées, la dérégulation du rythme circadien est concomitante à l’apparition de nombreuses pathologies inflammatoires et métaboliques chroniques et de cancers. Nos travaux récents (souris âgées) suggèrent un lien entre la dérégulation de la machinerie moléculaire associée au rythme circadien et l’altération des mécanismes de défense contre les infections bactériennes à pneumocoque, principale cause des pneumonies chez les personnes âgées. Nous montrons que l’expression de Rev-erba, un régulateur majeur de l’horloge biologique et un répresseur puissant de l’expression des gènes, échappe au contrôle de la machinerie circadienne. Nous démontrons également, pour la première fois, que Rev-erba altère les mécanismes de défense dirigés contre le pneumocoque (souris jeunes). Notre hypothèse est que l’expression incontrôlée de Rev-erba dans les poumons favorise la susceptibilité aux infections bactériennes respiratoires chez les personnes âgées.

Le premier objectif est de mieux comprendre les causes conduisant à l’expression incontrôlée de Rev-erba dans les poumons de souris âgées, d’en déterminer les sources cellulaires et d’identifier les gènes cibles de Rev-erba, notamment ceux codant pour des facteurs intervenant dans l’immunité innée. Notre hypothèse est que la sénescence cellulaire, connue pour induire une inflammation chronique à bas bruit au cours du vieillissement, favorise la dérégulation de l’expression de Rev-erba et ainsi l’immunité pulmonaire. Afin d’étudier ce postulat, un modèle unique de souris transgénique (p16-ATTAK) permettant d’éliminer les cellules sénescentes sera utilisé (souris âgées). Dans une perspective translationnelle, l’expression des gènes de l’horloge (dont Rev-erba), des marqueurs de sénescence et des gènes cibles de Rev-erba sera analysée au sein de poumons humains de sujets âgées (lobectomie pulmonaire).

Le deuxième objectif est de déterminer le rôle et les mécanismes par lesquels Rev-erba interfère avec l’immunité antibactérienne pulmonaire. Une approche génétique par délétion du gène et l’utilisation d’agonistes spécifiques régulant l’activité de Rev-erba seront développées. Les cellules épithéliales et les cellules myéloïdes sont importantes dans la régulation du rhythme circadien et dans le contrôle de l’inflammation pulmonaire. Nous déléterons sélectivement le gène Rev-erba au sein de ces cellules. Les signatures moléculaires et cellulaires (nombre, fonctions) seront identifiées chez les souris jeunes infectées ou non par Streptococcus pneumoniae. Nous établirons le lien entre l’expression et l’activité de Rev-erba, le rythme circadien et l’immunité anti-bactérienne.

Le troisième objectif est de manipuler l’activité de Rev-erba afin d’augmenter les défenses immunitaires des souris âgées. Ces dernières seront traitées avec un antagoniste puissant de Rev-erba afin de restaurer la robustesse de l’horloge et, ainsi, l’expression des effecteurs immuns impliqués dans la défense contre l’infection bactérienne.

Ce projet a un intérêt fondamental (lien entre horloge biologique et immunité) et biomédical. Il pourrait conduire à la mise en place de stratégies interventionnelles efficaces visant à renforcer les défenses des personnes âgées afin de limiter les pneumonies bactériennes.