CE15 - Immunologie, Infectiologie et Inflammation

Le rôle du trafic intracellulaire dans le control des maladies impliquant les récepteurs aux immunoglobulines – IDEA

Rôle du trafic intracellulaire dans le contrôle des maladies médiées par les récepteurs d'immunoglobulines

L'internalisation des complexes récepteur-ligand peut soit terminer, soit amplifier et maintenir la signalisation du récepteur. Cependant, le rôle de l'endocytose dans la signalisation de FcR n'a jamais été étudié. L' hypothèse du projet IDEA, étayée par nos données préliminaires, lève « la barrière scientifique » de la signalisation exclusive du FcR à partir de la membrane plasmique.

Objectifs

Les mécanismes par lesquels l'IRAP contrôle l'activation du FcR sont inconnus et seront étudiés par les 4 axes du projet IDEA :<br />WP1. Comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels IRAP facilite l'activation de Fc?Rs<br />Ce WP inclura des méthodes de biologie cellulaire (déplétion ou surexpression de protéines, microscopie, biotinylation in situ, spectrométrie de masse) dans le cadre d’une étude comparative entre les cellules wt et déficientes en IRAP.<br />WP2. Étudier in vivo le rôle d'IRAP sur les pathologies médiées par le Fc?R (glomérulonéphrite et arthrite)<br />Le consortium a mis en place des modèles murins d'arthrite et de glomérulonéphrite qui seront appliqués à des souris wt et déficientes en IRAP pour évaluer l'impact d’IRAP sur les maladies inflammatoires médiées par FcR.<br />WP3. Élucider si, à l'instar des Fc?R, l'activation de Fc?RI et le développement de maladies allergiques impliquent IRAP<br />Par une combinaison de méthodes de biologie cellulaire, de tests fonctionnels et de modèles d'anaphylaxie systémique murine, le projet analysera le rôle de l'IRAP dans la signalisation du Fc?RI et la progression des maladies allergiques.<br />WP4. Évaluer si l'inhibition de l'IRAP peut être un nouvel outil thérapeutique dans les maladies inflammatoires.<br />En utilisant les méthodes de biologie cellulaire et les tests fonctionnels mentionnés précédemment, le projet étudiera si l'inhibition chimique de l'enzyme modifiera l'activation des FcRs.

Biologie cellulaire : inactivation des protéines (shRNA lentiviral ou CRISPR/Cas9) ; surexpression des protéines, biotinylation in situ médiée par APEX2 et suivie de l’identification des plateformes de signalisation des FcRs par spectrométrie de masse, cytométrie en flux, cytométrie en flux couplée à l'imagerie (AMNIS), microscopie confocale et vidéomicroscopie à résolution améliorée, modèles murins d'inflammation médiée par FcR .

Nous avons démontré que différents FcR suivent des voies endocytiques distinctes. Ainis, FcaRI est internalisé dans les lysosomes, Fc?RIIA dans les endosomes précoces et le Fc?RIIB dans les autophagosomes. Le Fc?RI est dirigé dans les compartiments endosomaux décrits par l'Insulin Responsive AminoPeptidase (IRAP). Après internalisation, Fc?RI utilise des plates-formes de signalisation endosomales, qui dépendent de la présence d'IRAP. La déstabilisation de ces plateformes diminue la capacité des macrophages péritonéaux à tuer les cellules tumorales par cytotoxicité dépendante des anticorps. Ces résultats sont disponibles sur BioRxiv.
En parallèle, motivés par nos données in vitro sur la signalisation endosomale du FcR, nous avons étudié in vivo le rôle de l'IRAP dans l'inflammation induite par l’activation des FcRs. Nous avons montré que les souris déficientes en IRAP présentent une anaphylaxie systémique moins sévère que les souris wt et une arthrite auto-immune moins sévère également. L’analyse de mastocytes a révélé que les endosomes IRAP sont recrutés rapidement à la membrane plasmique lors de la stimulation de FceRI. Les cellules déficientes en IRAP ont un signal calcique réduit et des réponses sécrétoires réduites et une activation réduite de Syk. L'inhibition de Syk n’est pas due à des événements de signalisation précoce médiés par la kinase Lyn, mais à un changement de l'activité de la phosphatase SHP1. Ainsi, dans les mastocytes déficients pour IRAP, la phosphatase SHP1 est plus active que dans les cellules wt, ce qui conduit à une plus forte réponse inflammatoire. L’analyse ex vivo des neutrophiles et des monocytes isolés après une anaphylaxie déclenchée par IgG a confirmé aussi l’inhibition de Syk dans le cas de cellules déficientes pour IRAP. En résumé, nos résultats démontrent que les endosomes IRAP sont nécessaires pour l'amplification du signal de 3 récepteurs majeurs des immunoglobulines: Fc?RIIA, Fc?RI et FceRI.

Pour comprendre le mécanisme moléculaire par lequel l'IRAP amplifie la signalisation FcR, nous avons mis en place un test de biotinylation in situ en fusionnant le Fc?RIIA humain à la peroxydase APEX2. Nous avons vérifié l'expression et la localisation correcte de la protéine de fusion Fc?RIIA-APEX2 et mis au point le protocole de biotinylation. Les cellules DC2.4 exprimant Fc?RIIA-APEX2 ont été activées avec des anticorps anti-Fc?RIIA F(ab)2 complexés avec des anticorps secondaires et l'internalisation du récepteur a été vérifiée par microscopie confocale. Les protéines biotinylées in situ ont été purifiées et envoyées à la plateforme de spectrométrie de masse de l'Institut Pasteur. Lorsque les résultats seront disponibles, nous validerons les candidats les plus intéressants par délétion protéique, surexpression protéique et tests fonctionnels.

1. The high affinity IgE receptor: a signaling update. Blank U, Huang H, Kawakami T. Curr Opin Immunol. 2021 Apr 7;72:51-58. doi: 10.1016/j.coi.2021.03.015. Online ahead of print. PMID: 33838574 Review.
2. Cytoskeletal Transport, Reorganization, and Fusion Regulation in Mast Cell-Stimulus Secretion Coupling. Ménasché G, Longé C, Bratti M, Blank U. Front Cell Dev Biol. 2021 Mar 16;9:652077. doi: 10.3389/fcell.2021.652077. eCollection 2021. PMID: 33796537 Free PMC article. Review
3. High affinity Fc?R activating function depends on IRAP+ endosomal-signaling platforms. Samira Benadda, Mathilde Nugues, Marcelle Bens, Mariacristina De Luca, Olivier Pellé, Renato C. Monteiro, Irini Evnouchidou, Loredana Saveanu
doi: doi.org/10.1101/2021.06.24.449774

Les récepteurs de la surface cellulaire sont rapidement endocytés après activation. Dans le cas des récepteurs aux facteurs de croissance (RTK) et des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), l’endocytose peut conduire soit à la suppression, soit à l’amplification de la signalisation, en fonction de la force de l’activation du récepteur et / ou des voies d’endocytose impliquées dans l’internalisation du récepteur. Des récepteurs immunitaires majeurs, tels que les récepteurs activateurs aux fragments Fcs des immunoglobulines (FcR), sont également internalisés après la liaison du ligand, mais il n'est pas connu si leur endocytose termine ou soutient la signalisation. Cette question est particulièrement pertinente dans le cas des FcR, car en fonction de la valence de leurs ligands, ils peuvent engager soit une signalisation activatrice, soit une signalisation inhibitrice. Ainsi, les complexes immuns (IC) déclenchent une réponse inflammatoire en temps que les IgG solubles (telles que les IgIV) inhibent la réaction inflammatoire. Les mécanismes par lesquels le même récepteur est capable de déclencher des réponses pro ou anti-inflammatoires en fonction de la valence de son ligand ne sont pas clairs. Cependant, ils peuvent être cruciaux pour comprendre les processus pathogènes sous-jacents aux maladies à impliquant les FcR, notamment les glomérulonéphrites avec dépôt de complexes immuns, l'arthrite, les allergies et l'asthme.
Le projet IDEA est basé sur nos données préliminaires suggérant que l’internalisation des FcRs dans des endosomes de stockage, spécifiques de type cellulaire, dicte le résultat pro- ou anti-inflammatoire de l’activation du FcR. Ces endosomes sont décrits par l’Insulin Responsive AminoPeptidase (IRAP). Nous étudierons les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'internalisation des FcRs activés et les étapes de trafic qui régulent leur signalisation in vitro et in vivo au cours de 4 WP:
Dans le WP1, en combinant la biotinylation in vivo via la peroxydase APEX2, l’inactivation génique par CrispR / Cas9, la microscopie à résolution améliorée, nous prévoyons d’identifier à partir de quel compartiment intracellulaire le Fc?Rs activateurs déclenchent la réaction inflammatoire. Ce travail fondamental fournira une carte complète des plates-formes de signalisation cellulaire des Fc?Rs, ouvrant de nouvelles perspectives pour l'étude des mécanismes moléculaires conduisant à l'inflammation déclenchée par les Fc?Rs.
Dans le WP2, nous étudierons le rôle de la plate-forme de signalisation endosomale dans des conditions de déclenchement des réaction pro- et anti-inflammatoire via les FcRs. Nous validerons ensuite nos résultats in vivo en utilisant des modèles murins de maladies impliquant les FcyRs, telles que la glomérulonéphrite et l'arthrite. Enfin, nous étudierons également le trafic endosomal des FcRs dans des monocytes humaines provenant de donneurs sains et de patients souffrant de maladies inflammatoires, telles que le lupus et l'arthrite ou les récepteurs Fc intervient dans la pathologie. Les résultats obtenus sur des échantillons humains pourraient révéler de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic de ces maladies inflammatoires.
Dans le WP3, nous rechercherons si, comme le suggèrent nos données préliminaires, la signalisation du FceRI, le principal récepteur impliqué dans l’allergie, est également contrôlée par le système endosomal. Nous analyserons in vitro le trafic et la signalisation du FceRI dans les mastocytes dépourvus des composants des mécanismes d’endocytose qui seront identifiés dans le WP1. En utilisant différents modèles d'allergie, nous validerons in vivo les résultats obtenus sur la signalisation par FceR. Enfin, dans le WP4, nous utiliserons des modèles murins de glomérulonéphrite et arthrite pour tester l’impact de nouvelles petites molécules ciblant la signalisation endosomale et qui, dans nos expériences préliminaires, ont permis de diminuer l’inflammation provoquée par FcR.

Coordination du projet

Loredana SAVEANU (APreT team Saveanu)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CRI Equipe Immunorécepteurs et immunopathologie rénale
CRI équipe Charles/Blank- Basophiles, mastocytes et immunopathologie
CRI APreT team Saveanu

Aide de l'ANR 550 476 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2019 - 48 Mois

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