CE15 - Immunologie, Infectiologie et Inflammation

Interactions métaboliques entre les adipocytes et les trypanosomes, un nouveau paradigme pour les trypanosomoses – AdipoTryp

Interactions métaboliques entre adipocytes et trypanosomes, un nouveau paradigme pour les trypanosomoses pour la compréhension de la biologie du parasite

Étant donné que les adipocytes excrètent de grandes quantités de glycérol, nous avons émis l'hypothèse que les interactions entre les adipocytes et les trypanosomes extravasculaires, chez les hôtes mammifères, pourraient conférer un avantage sélectif aux parasites de la peau et le tissu adipeux. De plus, la préférence unique du glycérol au glucose développée par les insectes trypanosomes peut avoir un rôle crucial pour la croissance et/ou le développement du parasite dans son insecte vecteur.

Vers une meilleure compréhension du métabolisme du glycérol des trypanosomes pour la mise en évidence de nouvelles cible thérapeutiques

Trypanosoma brucei, l'agent responsable de la THA, était considéré comme se propageant exclusivement dans les fluides de son hôte mammifère. En rupture avec ce dogme, nous avons récemment montré que la plupart des parasites résident dans le compartiment extravasculaire, en particulier de la peau et du tissu adipeux, où ils sont en contact étroit avec les adipocytes. En résonance avec cette découverte majeure, nous avons récemment brisé un autre dogme en cultivant le parasite avec du glycérol à la place du glucose, qui était considéré comme la seule source de carbone alimentant le métabolisme central du parasite.<br />Comme les adipocytes excrètent de grandes quantités de glycérol via la lipolyse et la glycolyse, nous avons émis l’hypothèse que les trypanosomes extravasculaires tirent profit du glycérol produit par les adipocytes tissulaires.<br />Les objectifs de ce projet portant sur le métabolisme des trypanosomes sont (i) d'élucider le rôle du métabolisme du glycérol in vivo chez l'hôte mammifère, (ii) de développer un test in vitro pour étudier les interactions métaboliques entre adipocytes et trypanosomes en mettant à profil l'insensibilité du parasite à la suramine, médicament de première intention utilisé contre la THA (la sensibilité à la suramine est jusqu'à 70 fois réduite en présence de glycérol), (iii) de déterminer la(es) alternative(s) probable(s) à la FBPase, l'enzyme clé de la gluconéogenèse, ainsi que le rôle de la gluconéogenèse in vivo, et (iv) d'identifier la(es) enzyme(s) ciblée(s) par la suramine.

Nous avons récemment établi de nouvelles conditions de culture des formes sanguines (BSF) du parasite en remplaçant le glucose par du glycérol. Cela nous a conduit à montrer que les BSF cultivés avec du glycérol sont ~60 fois moins sensibles à la suramine (le médicament de première intention utilisé pour traiter les patients atteints de THA de stade 1), par rapport aux conditions avec du glucose. Cette résistance à la suramine liée au glycérol nous fournit un outil unique pour étudier les interactions métaboliques adipocytes-BSF in vitro et in vivo. En effet, la présence de suramine va pousser les BSF à utiliser le glycérol produit par les adipocytes pour alimenter leur métabolisme carboné central. Nous avons établi la preuve de concept de cette approche originale et ces expériences seront répétées avec des lignées cellulaires mutantes (glycérol kinase et aquaglycéroporine, entre autres). Afin de répondre à des questions spécifiques, les expériences in vivo seront complétées par des expériences in vitro, réalisées sur des lignées cellulaires BSF parentales et mutantes. (i) Dialogue moléculaire entre trypanosomes et adipocytes. Nous déterminerons si le glycérol produit par les adipocytes soutient la croissance des BSF en développant des conditions de co-culture BSF-adipocytes. Ces interactions métaboliques seront analysées par spectrométrie RMN (exométabolome) et spectrométrie de masse (endométabolome). (ii) Détection du glycérol pour le tropisme des tissus. Comme le glycérol n'est pas uniformément disponible dans tous les tissus, nous avons estimé que le tropisme du parasite pour la peau et les tissus adipeux peut nécessiter la détection d'agents chimio-attractifs, tels que le glycérol. (iii) Différenciation du BSF dans les tissus pour la transmission à la mouche. Les données préliminaires ont montré que le glycérol stimule la différenciation des BSF-sl multiplicatifs en BSF-st non-multiplicatifs. Nous utiliserons des protocoles standard in vitro pour la différenciation de BSF-sl en BSF-st, puis en trypanosomes procycliques (PCF).
Le rôle du métabolisme du glycérol dans le développement des PCF dans l'insecte vecteur sera abordé in vitro et in vivo avec différentes lignées cellulaires mutantes. Nous utiliserons un modèle déjà optimisé dans notre réseau qui imite le développement du parasite lors d'une surexpression de RBP6. La production de formes épimastigotes puis de formes métacycliques (glandes salivaires) par les formes procycliques parentales et mutantes (intestin moyen) surexprimant RBP6 sera quantifiée par des marqueurs spécifiques au stade P6 en présence ou absence de glycérol. Des analyses in vivo du développement des trypanosomes dans l'insecte vecteur seront effectuées en surveillant la colonisation de l'intestin moyen et des glandes salivaires.

1- Interactions métaboliques entre adipocytes et trypanosomes in vivo
- Pour étudier cet aspect nous avons produit un triple mutant knockout KOaqp1/2/3 (aquaglycéroporine) incapable de transporter et donc de métaboliser le glycérol. Dans le modèle souris, ce mutant montre un retard important dans sa capacité à envahir les tissus de l'animal infecté, suggérant que le glycérol à un rôle dans la propagation du parasite in vivo. Le traitement des animaux infectés par ce mutant avec la suramine, qui est létale pour les parasites consommant le glucose, est en cours. Nous nous attendons à ce que le mutant ne puisse plus coloniser les tissus, contrairement à la souche parentale.
- Nous avons également produit un mutant KO des gènes codant pour la glycérol kinase (GK) dans les BSF en utilisant une nouvelle approche basée sur la technologie CRISPR-Cas9. En effet, les 11 copies du gène GK ont été éliminées en une seule transfection des BSF avec le guide, la cassette contenant le gène de résistance et la Cas9 recombinante. Cette nouvelle approche sera soumise pour publication d'ici la fin de l'année. Les lignées KOgk et «rescues« (en cours de production) seront utilisées pour infecter les souris traitées ou non à la suramine.
- Nous avons également participé à la caractérisation des formes parasitaires des tissus adipeux (Trindade et al., Nat Microbiol, En révision). Ces formes se multiplient plus lentement que les formes sanguines et présentent les caractéristiques de formes persistantes.

2- Interactions métaboliques entre adipocytes et trypanosomes in vitro
- Nous avons observé que l'ajout d'insuline et d'un inhibiteur de la lipolyse permet de multiplier par 7 la production de glycérol des adipocytes, dans des concentrations compatibles avec la croissance des parasites. Des données préliminaires de co-cultures entre adipocytes et trypanosomes BSF montrent que les trypanosomes utilisent le glycérol produit par les adipocytes, même en présence de glucose. Ces données préliminaires suggèrent que les adipocytes influenceraient le métabolisme des trypanosomes, car ces derniers préfèrent le glucose au glycérol, lorsque cultivés seuls.
- Nous avons récemment montré que les formes procycliques (PCF) de trypanosomes préfèrent métaboliser le glycérol au glucose en utilisant un nouveau mode de régulation de l'utilisation des sources de carbone appelé «metabolic contest« (Allemann, PLoS Biol, 2021). Nous pensons que c'est également le cas pour les BSF en co-culture avec les adipocytes, hypothèse que nous sommes testons in vitro.

3- Néoglucogenèse à partir du glycérol
Nous n'avons participé à la démonstration que la PFK peut fonctionner in vitro dans le sens de la néoglucogenèse (Fernandes, 2019). Ces travaux sont en accord avec notre hypothèse que la PFK est impliquée dans la production de F6P à partir de F1,6BP. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré une lignée RNAi inductible ciblant la PFK (RNAi-PFK) actuellement en cours d'analyse.

Les données que nous allons accumuler apporteront une meilleure compréhension du développement du parasite dans son hôte mammifère, en particulier au niveau des tissus adipeux et de la peau. Nous avons récemment démontré pour la première fois que les patients testés présentaient des parasites dans la peau, y compris ceux dont la sérologie était négative (M. Camara et al., Clin Infect Dis, 2020). Ces résultats mettent en évidence que la peau est un réservoir potentiel pour les trypanosomes africains, avec des implications pour notre compréhension de l'épidémiologie de cette maladie dans le contexte de son élimination planifiée. Au-delà de la compréhension de la biologie du parasite in vivo, nos travaux ont également pour objectif de participer au développement de nouveaux moyens thérapeutiques contre les formes tissulaires du parasite.

MULTIPARTENAIRE
Allmann S., M. Wargnies, E. Cahoreau, M. Biran, N. Plazolles, P. Morand, E. Pineda, H. Kulyk-Babier, C. Asencio, O. Villafraz, L. Rivière, E. Tetaud, B. Rotureau, A. Mourier, J.-C. Portais, & F. Bringaud (2021) Glycerol suppresses glucose consumption in trypanosomes through metabolic contest. PLoS Biol. 19:e3001359. (article)

Villafraz O., M. Biran, N. Plazolles, E. Cahoreau, R. Ornitz Oliveira Souza, E. Tetaud, L. Rivière, A. Silber, M.P. Barrett, A. Zikova, M. Boshart, J.-C. Portais & F. Bringaud (2021) Procyclic Trypanosomes Recycle Glucose Catabolites and TCA Cycle Intermediates to Stimulate Growth in the Presence of Physiological Amounts of Proline. PLoS Pathog. 17:e1009204. (article)

Villafraz O., H. Baudouin, M. Mazet, H. Kulyk, J.-W. Dupuy, C. Botté, D. Inaoka, J.-C. Portais & F. Bringaud (2021) The Trypanosome UDP-Glucose Pyrophosphorylase Is Imported by Piggybacking into Glycosomes, Where Unconventional Sugar Nucleotide Synthesis Takes Place. mBio 12:e0037521. (article)

MONOPARTENAIRE
Mochizuki K., D.K. Inaoka, M. Mazet, T. Shiba, K. Fukuda, H. Kurasawa, Y. Millerioux, M. Boshart, E.O. Balogun, S. Harada, K. Hirayama, F. Bringaud & K. Kita (2020) The ASCT/SCS cycle fuels mitochondrial ATP and acetate production in Trypanosoma brucei. BBA Bioenergetics. 1861:148283. (article)

Michels P.A.M, O. Villafraz, E. Pineda, M.B. Alencar, A.J. Cáceres, A.M. Silber & F. Bringaud (2021) Carbohydrate metabolism in trypanosomatids is not quite so simple. Exp. Parasitol. 224:108102. (revue

Camara M, Soumah AM, Ilboudo H, Travaillé C, Clucas C, Cooper A, Kuispond Swar NR, Camara O, Sadissou I, Calvo Alvarez E, Crouzols A, Bart JM, Jamonneau V, Camara M, MacLeod A, Bucheton B, Rotureau B. (2021) Extravascular Dermal Trypanosomes in Suspected and Confirmed Cases of gambiense Human African Trypanosomiasis. Clin. Infect. Dis. Jul 1;73(1):12-20. (article)

Lagarde D, Jeanson Y, Portais JC, Galinier A, Ader I, Casteilla L, Carrière A. (2021) Lactate Fluxes and Plasticity of Adipose Tissues: A Redox Perspective. Front Physiol.12:689747. (revue)

Lagarde D, Jeanson Y, Barreau C, Moro C, Peyriga L, Cahoreau E, Guissard C, Arnaud E, Galinier A, Bouzier-Sore AK, Pellerin L, Chouchani ET, Pénicaud L, Ader I, Portais JC, Casteilla L, Carrière A. Lactate fluxes mediated by the monocarboxylate transporter-1 are key determinants of the metabolic activity of beige adipocytes. (2021) J Biol Chem. 296:100137. (article)

Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire extracellulaire transmis par la mouche tsétsé et responsable de la Trypanosomose Humaine Africaine (THA), une maladie tropicale négligée d’Afrique subsaharienne avec un taux de létalité proche de 100%. Il n’existe pas de vaccin et les médicaments actuels présentent un certain nombre d’effets secondaires. D'autres espèces de parasites apparentées sont responsables des trypanosomoses animales qui restent un obstacle majeur à l'élevage dans les pays d'Afrique subsaharienne.
Il était admis que les trypanosomes se propageaient exclusivement dans les fluides, principalement le sang, de ses hôtes mammifères. En rupture avec ce dogme, 3 publications récentes ont montré que la plupart des parasites en modèles murins résident dans le compartiment extravasculaire des tissus adipeux et de la peau, à partir de laquelle les trypanosomes peuvent être transmis. Ces parasites extravasculaires semblent interagir étroitement avec les adipocytes cutanés, cellules principales du tissu adipeux, ce qui pourrait leur conférer un avantage sélectif. En effet, en résonance avec cette découverte, nous avons brisé un autre dogme, considérant que T. brucei dépendait exclusivement du glucose sanguin pour alimenter son métabolisme central, en cultivant le parasite avec du glycérol à la place du glucose. Comme les adipocytes excrètent de grandes quantités de glycérol lors de la lipolyse et de la glycolyse, nous avons émis l’hypothèse que les trypanosomes extravasculaires pourraient tirer parti de cette production de glycérol pour (i) alimenter leur métabolisme carboné central et (ii) coloniser les tissus contenant des adipocytes par chimiotactisme. Nos données préliminaires détaillées dans le projet étayent ces 2 hypothèses.
Les objectifs de ce projet portant sur le métabolisme des trypanosomes sont (i) d’élucider l’importance du métabolisme du glycérol in vivo, ainsi que son rôle de signal métabolique pour attirer les parasites dans les tissus, (ii) de développer un test in vitro pour étudier les interactions métaboliques entre les adipocytes et les trypanosomes, (iii) de déterminer la(es) alternative(s) à la FBPase, enzyme clé de la néoglucogenèse, ainsi que le rôle de la néoglucogenèse du parasite in vivo, (iv) de confirmer l’existence et de déterminer le rôle de la ß-oxydation des acides gras, proposée comme étant activée chez les parasites tissulaires, et (v) d’identifier la(es) étapes métabolique(s) pertinente(s) ciblée(s) par la suramine. Toutes ces questions seront abordées par des équipes expertes dans des domaines complémentaires constituant un réseau dynamique de longue date.
Ce projet aura un impact majeur sur la compréhension de la biologie des trypanosomes tissulaires et ouvrira également la voie au développement d'approches thérapeutiques ciblant les parasites extravasculaires.

Coordination du projet

Frederic BRINGAUD (MICROBIOLOGIE FONDAMENTALE ET PATHOGÉNICITÉ)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

iMM Universidade de Lisboa / Instituto de Medicina Molecular
LBM Laboratoire de biogenèse membranaire
LISBP LABORATOIRE D'INGÉNIERIE DES SYSTÈMES BIOLOGIQUES ET DES PROCÉDÉS
IPP INSTITUT PASTEUR
MFP MICROBIOLOGIE FONDAMENTALE ET PATHOGÉNICITÉ

Aide de l'ANR 696 646 euros
Début et durée du projet scientifique : mars 2020 - 48 Mois

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