CE15 - Immunologie, Infectiologie et Inflammation

Bases structurales de l'ancrage à la chromatine des génomes viraux – CApTIVE

CApTIVE (ChromAtin TetherIng by Viral gEnomes)

L'ancrage à la chromatine par la protéine retrovirale Gag est un prérequis à une integration optimale du prototype foamy virus (PFV). L'interface de liaison entre Gag et le nucléosome dicte l'affinité entre les deux protéines. L'alteration de cette affiné par des substitutions, induit des phénotypes de redirection des sites d'intégration. Le but de ce projet est de caractériser les déterminants moléculaires expliquant ces phénotypes de redirection de l'intégration.

Mise en évidence des mécanismes moléculaires impliqués dans l'ancrage au nucléosome de la protéine Gag du PFV

La chromatine cellulaire est une structure dynamique capable de passer d'un état condensé à un état relâché et vice versa. Au sein d'un nucléosome, cette transition fait intervenir la queue d'histone H4 ainsi qu'une zone appelée «H2A/H2B acidic patch« (AP). En fixant l'AP du nucléosome voisin, la queue H4 permet ainsi l'initiation de la compaction.<br />Nous avons montré que la protéine Gag du PFV est capable de fixer l'AP et que cette liaison est importante pour la selection des sites d'intégration lors de l'infection. En raison du role important de l'AP dans la formation de structure complexe de chromatine, une question importante sans réponse est de déterminer le potentiel role de Gag dans la modulation de l'architecture de la chromatine en compétant avec H4 pour l'AP. A travers la caractérisation structurale et moléculaire poussée de l'interaction entre Gag et le nucléosome, ce projet vise donc à déterminer la fonction exacte de l'ancrage à la chromatine des protéines virales. Nous avons scindé notre étude en trois parties; 1) mieux comprendre les déterminants structuraux de l'interaction entre Gag et le nucléosome, 2) caractériser les zones de l'acidic patch impliqués dans l'ancrage des protéines virales et leur fonction en cellule et 3) quantifier l'impact de l'interaction entre Gag et l'acidic patch sur la modulation de la structure de la chromatine.

I- Bases structurales de l'interaction des protéines rétrovirales au nucléosome
Dans cette partie nous utilisons une combinaison d'approches structurales et biochimiques. Nous avons développé la production de nucléosomes et polynucléosomes compatibles pour des utilisations en cristallographie des rayons X et cryo-EM. Ces mêmes structures seront utilisées en biochimie pour des expériences d'interaction par pull down, calorimétrie ou interférométrie.
II- Implications fonctionnelles de la capture du nucléosome par les protéines virales
Cet axe fait intervenir des approches cellulaires et un système rapporteur de l'infection PFV. Nous avons produit des particules virales comportant des substitutions sur la protéine Gag. Ces substitutions sont rationalisées par les approches structurales et la conservation des résidus dans différentes souches virales. Elles font intervenir des résidus de Gag interagissant dans des cavités de l'acidic patch. Par des approches d'immunofluorescence lors de l'infection nous pouvons suivre le trafficking des virus dans la cellule. Nous avons élaboré un système d'infection sur cellules synchronisées pour déterminer la cinétique exacte de capture de la chromatine lors de la mitose.
III- Modulation de la structure de la chromatine par les protéines virales
Grace à la purification au laboratoire des ADN et protéines recombinants nous avons dorénavant la capacité d'assembler des structures complexes de chromatine de type polynucleosomes de 10nm et fibre de chromatine de 30nm via l'ajout de l'histone H1. Nous avons initiés des experiences de microcentrifugation en présence de Mg. Le Mg est décrit comme oligomérisant les polynucléosomes. Nous avons reproduit les données de la littérature sur les concentrations nécessaires induisant ces oligomérisations. Ceci est notre point de départ pour déterminer si la présence de protéines virales fixant l'acidic patch affecte la concentration de Mg nécessaire pour oligomériser nos structures de chromatine.

Par des approches biochimiques, nous avons montrés que les substitutions R540Q et Y537Q sont fortement affectés pour l’interaction avec le nucléosome (affinités : wt > Y537Q > R540Q) mais également que la compaction des polynucléosomes affecte préférentiellement l’interaction avec les mutants alors que la protéine sauvage retient sa capacité d’interaction.
Suite au recrutement d’un post-doc, des expériences d’infections et de suivi par immunofluorescence ont été effectuées. Celles ci faisaient intervenir la comparaison de la cinétique d’accès à la chromatine entre des virus sauvage vs les mutants d’ancrage à la chromatine. Nous avons pu mettre en évidence par des synchronisations cellulaires que le virus sauvage capture la chromatine dès les premiers instants de la mitose après désassemblage de l’enveloppe nucléaire. La cinétique d’accès à la chromatine change lorsque nous suivons les virus R540Q et Y537Q. Le virus R540Q, le plus altéré dans sa fixation à la chromatine, produit le même phénotype que publié précédemment. En revanche le virus Y537Q possède un comportement unique. En effet nous observons une « pause » des virus aux centrosomes lors des phases précoces de la mitose (alors que le virus sauvage bascule sur la chromatine) pour ensuite migrer vers la chromatine lors de la télophase (fin de mitose). Ce phénotype s’accompagne également d’une redirection des sites d’intégrations.
Cette différence de timing d’ancrage peut être expliquée par la nécessité d’une décondensation de la chromatine mitotique telle qu’elle s’opère en début de télophase. Nos données biochimiques in vitro montrant une forte sensibilité des virus mutants à la compaction de la chromatine corroborent cette observation.

Nos perspectives se déclinent en deux temps. A court terme nous prévoyons de finaliser l'étude de la cinétique d'ancrage à la chromatine du PFV en affinants quelques observations afin de soumettre un manuscript pour publication d'ici la fin de l'année. Ensuite à plus long terme, nous envisageons de poursuivre le projet de caractérisation de modulation de la structure de la chromatine par les protéines virales. En nous basant sur des données préliminaires récentes, nous investiguerons également la capacité de la protéine Gag à induire de la séparation de phase liquide-liquide et la relation de ce processus dans l'organisation nucléaire des processus viraux.

Nous avons une mini review en cours de révision dans le journal mBio.
Targeting the nucleosome acidic patch by viral proteins: two birds with one stone? Lagadec et al. mBio

La chromatine cellulaire adopte une variété de structure et sa dynamique est cruciale lors de la réplication, transcription et réparation de l’ADN. La modulation de la compaction chromatinienne est médiée par l’interaction entre la queue N-terminale d’histone H4 et le patch acidique du nucléosome adjacent. Ce patch constitue une zone d’ancrage pour des protéines virales telles que LANA chez le Kaposi sarcoma herpes virus, IE1 du cytomegalovirus et Gag des Spumaretrovirus. Il a été montré que LANA et IE1 pouvaient affecter le degré de compaction de la chromatine in vitro mais l’implication fonctionnelle reste indéterminée. Nous avons récemment résolu la structure de la protéine Gag en complexe avec un nucléosome et montré que cette interaction est cruciale pour une infection optimale. A travers l’utilisation d’approches complémentaires de biologie structurale, cellulaire et biophysique nous désirons dans ce projet décortiquer les mécanismes moléculaires impliqués lors de l’interaction entre les rétrovirus et le nucléosome ainsi que les conséquences fonctionnelles sur la réplication virale et sur l’architecture de la chromatine. Une meilleure connaissance de ces mécanismes moléculaires d’interaction entre les virus et l’hôte est d’un intérêt majeur à la fois dans le domaine de la virologie mais également dans le domaine de la chromatine pouvant ouvrir à de potentielles perspectives d’applications médicales.

Coordination du projet

Paul Lesbats (MICROBIOLOGIE FONDAMENTALE ET PATHOGÉNICITÉ)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

MFP MICROBIOLOGIE FONDAMENTALE ET PATHOGÉNICITÉ

Aide de l'ANR 444 744 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2019 - 48 Mois

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