CE14 - Physiologie et physiopathologie

Défauts des mitochondries et des protéases dans les cellules du syndrome progéroïde de Cockayne et pendant des processus associés au vieillissement – CS_AGE

Dysfonctionnement mitochondrial et des protéases dans les cellules de patients avec le syndrome progéroïdes de Cockayne et au cours des processus associés à l'âge

Comprendre les défauts moléculaires responsables des maladies du vieillissement prématuré comme le syndrome de Cockayne (CS) est essentiel pour développer des traitements, qui font cruellement défaut à ce jour, et élucider également le vieillissement physiologique. Nous avons identifié une voie altérée portant sur un dysfonctionnement mitochondrial dans les cellules de patients CS, et corrigé ces défauts en agissant sur les stress oxydant/nitrosatif avec des perspectives thérapeutiques.

Identifier les mécanismes de ces altérations cellulaires et leur impact sur le vieillissement prématuré. Nous visons une intervention clinique pour le CS et peut-être le vieillissement physiologique.

Nous étudions le mécanisme sous-jacent de la voie altérée que nous avons identifiée dans les cellules CS, où le stress oxydatif et nitrosatif (ROS/RNS) favorisent la surexpression de la protéase HTRA3, ce qui entraîne la dégradation de l'ADN polymérase mitochondriale POLG1 responsable de la réplication du génome de l’organite, et déclenche un dysfonctionnement mitochondrial. Ces défauts ont été corrigés dans les cellules de patients CS, en piégeant des molécules oxydantes/nitrosatives avec un dérivé de porphyrine, MnTBAP, ouvrant la voie à des approches thérapeutiques pour CS.<br /><br />La présente étude comporte quatre tâches :<br /> <br />Tâche 1. Évaluer le mécanisme par lequel la surexpression de HTRA3 entraîne une déplétion en POLG1 et, à son tour, un dysfonctionnement mitochondrial.<br /><br />Tâche 2. Lier les modifications épigénétiques spécifiques aux cellules CS aux changements d’expression génique, pour l'identification de nouveaux effecteurs de ces défauts, et évaluer si ces modifications sont inversées lors du traitement MnTBAP.<br /><br />Tâche 3. Corréler les altérations des cellules CS avec les phénotypes cliniques à des fins diagnostiques et thérapeutiques. Pour cela, nous profitons également de la génération d'organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), produits par notre consortium, et de cellules différenciées, visant des traitements personnalisés avec le MnTBAP (développement du laboratoire au lit d’hôpital).<br /><br />Tâche 4. Étudier les altérations du CS au cours du vieillissement normal. Nous avons démontré les défauts CS au cours de la sénescence des cellules normales, un processus lié au vieillissement. Cette analyse inclut l’examen de changements épigénétiques communs au CS et au cours du vieillissement normal, dans le but d’identifier des facteurs impliqués dans ces deux processus.

Pour évaluer les composants mitochondriaux qui sont affectés dans les cellules CS, nous avons utilisé le fractionnement subcellulaire, le fractionnement en gradient, le silençage médié par les lentivirus, et la surexpression de gènes d'intérêt, la co-immunoprécipitation, la microscopie à super-résolution et autres approches de biologie moléculaire et cellulaire dans les fibroblastes dérivés de patients et les fibroblastes immortalisés.
Dans des cellules dérivées de patients, nous avons effectué une méthylation de l'ADN à l'échelle du génome complet, le séquençage de l’ARN (RNAseq, suivis par une analyse bioinformatique des gènes et des voies biochimiques impliquées.

Pour répondre à la question de la grande variabilité clinique du CS chez les patients porteurs de mutations très proches, nous avons généré des modèles cellulaires isogéniques (mutations et type sauvage dans
des génomes par ailleurs identiques), avec des mutations CSB trouvées chez des patients présentant soit une forme grave ou légère de la maladie. Une force de notre paradigme pour étudier le CS est l'occurrence d'une
maladie (UVSS) due aux mêmes mutations que CS, et caractérisée par la photosensibilité car le CSB est impliqué dans la réparation des dommages à l'ADN induits par les UV, mais pas de phénotype progéroïde et
neurodégénératif. Nous nous concentrons sur les défauts mécanistiques présents dans le CS et absents en UVSS, pour identifier les facteurs conduisant à la progéria et à la neurodégénérescence.

En raison de la limitation des types cellulaires provenant des patients et de leur potentiel d'amplification restreint,nous avons généré des iPSCs et des organoïdes cérébraux (COs) à partir de fibroblastes de patients.
Les COs sont des structures neuronales en 3D qui contiennent plusieurs types de cellules et une cytoarchitecture qui ressemble au début du développement du cerveau humain. Les COs sont utilisés comme modèles avancés pour l’étude des maladies neurodégénératives. Nous avons sélectionné les COs (c’est a dire les fibroblastes de patients à partir desquels les COS sont dérivés) en raison de la gravité de la neurodégénérescence dans ces patients CS. Des iPSCs et des COs isogéniques ont également été générés pour démêler les défauts fonctionnels de ces organoïdes dus à la seule mutation CSB de son expression dans un contexte génétique donné.

1) Nous avons identifié un mécanisme qui réduit les niveaux de la protéine POLG1 mitochondriale, un défaut clé des cellules CS et qui est lié au phénotype progéroïde. Ce mécanisme est également important pour les cellules normales, car on ne savait pas comment est régulée l'homéostasie de cette protéine mitochondriale essentielle. Nous avons découvert que dans les cellules normales, ce processus est activé pendant la sénescence réplicative, fournissant ainsi un lien mécanistique supplémentaire entre un défaut progéroïde et un processus lié au vieillissement.
Manuscrit en préparation (Ms1_Fernandez Molina et al).

2) L'analyse de la méthylation de l'ADN (ADNm) a montré des changements épigénétiques dans trois catégories principales de gènes : les facteurs de transcription développementaux, les transporteurs transmembranaires et les facteurs d'adhésion cellulaire, qui apparaissent comme les principaux déclencheurs du vieillissement accéléré.
Nous avons également identifié des changements d’ADNm spécifiques du vieillissement accéléré (SC seul ou en commun avec d'autres maladies progéroïdes) et également des gènes en commun avec le vieillissement normal. Nous avons ainsi établi une signature d’ADNm spécifique pour le vieillissement accéléré (CS) et une en commun avec le vieillissement régulier. Quelques gènes de l'une et de l'autre catégorie sont en cours d'analyse fonctionnelle.
BioRxiv_2021_445308 et manuscrit en cours de révision (Ms2_Crochemore et al).

3) Pour surmonter un problème inattendu, nous avons généré plus de modèles cellulaires isogéniques que prévu initialement,aboutissant finalement à un paradigme expérimental plus robuste et plus diversifié que prévu initialement pour les études en cours.

4) Nous avons généré des organoïdes cérébraux (COs) dérivés de cellules de patients et des témoins sains respectifs. Pour cela, il y a eu un transfert de technologie important de P3-Yates (Sup'Biotech) vers l'Institut Pasteur (P1-Ricchetti). Les deux laboratoires sont désormais autonomes pour ceci et nous améliorons la technologie visant à augmenter l'homogénéité des des COs. L'analyse moléculaire, cellulaire et structurelle des COs a été lancée, avec des approches que nous avons optimisées pour cet objectif. Phénotypiquement, les CS-CO semblent plus petits que les WT-CO, un défaut que nous analysons maintenant sous de multiples aspects et qui pourrait avoir des liens mécanistiques avec la microcéphalie observée chez les patients CS. L'état de l'art et le potentiel de ces modèles semblent dépasser les prévisions indiquées dans le projet initial.

5) Nous avons également analysé en litérature le rôle de plusieurs espèces réactives dans le syndrome de Cockayne et plus généralement dans les maladies progéroïdes et le vieillissement. Cette revue a été acceptée dans le journal Antioxidant Redox Signalling, qui est influente dans ce domaine.
(Ms_3, Crochemore et al), 2021, publié en ligne avant impression PMID :34428933, DOI : 10.1089/ars.2020.8242

Nous avons développé notre projet avec une adéquation remarquable aux plans, malgré la fermeture partielle et une activité réduite en raison de la situation de Covid-19. Nous continuerons à suivre la feuille de route indiquée dans le projet, car elle s'est avérée bien planifiée.

Nous profiterons du développement des organoïdes cérébraux (CO) que nous avons développés avec succès, et analyserons les mécanismes défectueux dans ces structures, en utilisant des approches biochimiques, et de biologie moléculaire et cellulaire. Par immunofluorescence nous évaluerons les possibles altérations de la composition et de l'organisation cellulaire et de la cytoarchitecture des COs dérivés de patients CS et UVSS. Nous effectuerons ces analyses également dans des modèles isogéniques pour identifier le rôle des différents mutations per se dans la cytoarchitecture du CO et évaluer également si les fonds génétiques y jouent un rôle important. Nous reprogrammerons davantage d'iPSCs à partir de fibroblastes de patients présentant des processus neurodégénératifs d'intérêt, puis en dériverons les CO correspondants. Nous réaliserons également des expériences sur des neurones différenciés à partir d’iPSCs. Le rôle de la molécule MnTBAP (qui a rétabli des paramètres normaux dans les fibroblastes de patients) sera testée à différents stades de la formation des COs (ou de neurones différenciés en 2D) pour évaluer si les défauts potentiels sont récupérés. (Tâche 3).

Nous effectuerons une analyse du transcriptome complet de fibroblastes pour identifier les gènes et les voies qui sont altérés dans le CS en général ou dans certaines formes de la maladie (formes graves, courantes, légères), et encore une fois ceux qui sont communs à d'autres conditions de vieillissement (autres maladies progéroïdes, vieillissement physiologique). Nous analyserons également la corrélation entre la méthylation de l'ADN et les changements d'expression génique, pour comprendre quels changements épigénétiques modulent l'expression dans le CS. Ces études seront étendues à des échantillons sélectionnés de neurones et d'iPSCs. (Tâches 2 et 4).

Nous analyserons les mécanismes des changements conduisant à un dysfonctionnement mitochondrial dans les fibroblastes CS en évaluant la réplication et la transcription de l'ADN mitochondrial, ainsi que le complexe de réplication de cet ADN, comme indiqué dans le projet. Une partie de ces analyses sera également menée dans des neurones dérivés d'iPSCs à leur tour dérivées de patients CS avec diverses sévérité clinique et de patients UVSS pour évaluer la persistance et l'étendue des défauts CS dans les cellules neurales. (Tache 1). Cette partie du projet a été partiellement retardée en raison des restrictions de laboratoire dues au Covid-19, car nous avons dû en priorité maintenir actives les cultures cellulaires à long terme (fibroblastes, iPSCs et organoïdes cérébraux, Tâches 2-4). Cette partie sera développée dans la seconde moitié du projet.

Clément Crochemore, Claudia Chica, Paolo Garagnani, Giovanna Lattanzi, Steve Horvath, Alain Sarasin, Claudio Franceschi, Maria Giulia Bacalini, and Miria Ricchetti. Epigenomic signature of the progeroid Cockayne syndrome exposes distinct features of accelerated ageing. BioRxiv_2021_445308.

Clément Crochemore, Chiara Cimmaruta, Cristina Fernandez Molina, Miria Ricchetti. Reactive species in progeroid syndromes and ageing-related processes. Antioxidant Redox Signalling. Publié en ligne avant impression t, PMID: 34428933, DOI: 10.1089/ars.2020.8242

Les mécanismes qui gouvernent le vieillissement n’ont pas été résolus et constituent une question fondamentale en biologie cellulaire et des organismes. Exceptionnellement, dans certaines maladies génétiques rares comme le syndrome de Cockayne (CS), le vieillissement est fortement accéléré. La connaissance de ces mécanismes est essentielle pour mettre en œuvre des stratégies de prévention ou therapeutiques. Cette maladie manque cruellement de traitements.

Coordination du projet

Miria RICCHETTI (INSTITUT PASTEUR)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IRCCS-ISNB IRCCS Istituto delle Scienze Neurologiche di Bologna / IRCCS Istituto delle Scienze Neurologiche di Bologna
CellTechs ISBP - SUP BIOTECH PARIS
LGM LABORATOIRE DE GÉNÉTIQUE MÉDICALE (UMR_S 1112)
IP-SCD INSTITUT PASTEUR

Aide de l'ANR 682 855 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2019 - 42 Mois

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