Un centre de contrôle majeur dans les réponses aux dommages à l’ADN : fonction et régulation associées au module RBR – RHiD

Le projet a exploité diverses technologies biologiques, combinant :
- des approches génétiques, nécessitant la génération de lignées mutantes d'Arabidopsis, basées sur l'insertion d'ADN-T et les technologies CRISPR-Cas, ou la génération de lignées rapportrices ; comparaison en conditions de culture contrôle ou de stress induit par des agents génotoxiques.
- analyses transcriptionnelles de gènes candidats (par RT-qPCR), ou à l’échelle du transcriptome (RNA sequencing)
- analyses classiques de protéines (western-blot, localisation à l'aide de lignées rapportrices et/ou immunodétection)
- tests d'interaction protéique (Yeast-Two-Hybrid, immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse)
- test de stabilité des protéines (traitement par inhibiteurs chimiques, test d'ubiquitylation)

Dans ce projet, la fonction des protéines stabilisantes dé-ubiquitinases UBP12 et UBP13, qui interagissent avec KNO1, a été élucidée. Il est intéressant de noter que cette recherche a permis de positionner KNO1, cible de RBR1, comme nœud de signalisation dans le contrôle de la stabilité des protéines via le protéasome et l'autophagie, et a révélé pour la première fois l'autophagie dans le contrôle de la DDR chez les plantes, ouvrant un nouvel axe de recherche.
En outre, le rôle de la protéine F-box FBL17 en tant qu’acteur majeur du contrôle de la dégradation via le protéasome a été complété. Bien que déjà identifiée pour contrôler la progression du cycle cellulaire dans un module de régulation associé aux KRP, à CDKA;1, à E2FA et RBR1, il a été montré que la perte de fonction de FBL17 entraîne une augmentation de la transcription des gènes DDR connus, et que la protéine FBL17 colocalise avec RBR1 en condition de stress à l’ADN. Plusieurs nouvelles fonctions de FBL17 intégrées dans les voies de DDR ont été élucidées.

Ce projet a permis de générer des connaissances clés sur les aspects fondamentaux de la réponse aux dommages à l'ADN chez les plantes. D'une part, le rôle de la protéine F-box FBL17 dans la signalisation de la réponse aux dommages à l'ADN, et celui du module FBL17-RBR1, directement localisé aux sites de lésion de l'ADN, ont été révélés et renforcent l'implication de la dégradation des protéines protéasome-dépendante dans la DDR des plantes. D'autre part, une avancée majeure a été la découverte de l'autophagie comme mécanisme associé à la DDR des plantes, soulignant en particulier le rôle de KNO1 (cible de RBR1), comme nœud de signalisation du contrôle des lésions de l'ADN entre le protéasome et l'autophagie. Ces résultats représentent un grand potentiel pour les programmes d’amélioration variétale visant à optimiser la croissance des plantes en conditions de stress.

- Gentric N, Masoud K, Journot RP, Cognat V, Chabouté M-E, Noir S, Genschik P. The F-box-like protein FBL17 is a regulator of DNA-damage response and co-localizes with RETINOBLASTOMA RELATED 1 at DNA lesion sites. Plant Physiol. 2020 doi.org/10.1104/pp.20.00188
- Gentric N, Genschik P, Noir, S. Connections between the cell cycle and the DNA Damage response in plants. Int. J. Mol. Sci. 2021 doi.org/10.3390/ijms22179558
- Lang L, Pettkó-Szandtner A, Tunçay Elbasi H, Takatsuka H, Nomoto Y, Zaki A, Dorokhov S, De Jaeger G, Eeckhout D, Ito M, Magyar Z, Bögre L, Heese M, Schnittger A. The DREAM complex represses growth in response to DNA damage in Arabidopsis. Life Sci Alliance. 2021 doi.org/10.26508%2Flsa.202101141
- Chen P, De Winne N, De Jaeger G, Ito M, Heese M, Schnittger A. KNO1-mediated autophagic degradation of the Bloom syndrome complex component RMI1 promotes homologous recombination. EMBO J. 2023. doi.org/10.15252/embj.2022111980
- Lang L, Böwer F, Tunçay Elbasi H, Eeckhout D, Marschlich N, de Jaeger G, Heese M, Schnittger A. The two plant-specific DREAM components FLIC and FLAC repress floral transition in Arabidopsis. Development. (in revision)
- The lowdown on breakdown: Open questions in plant proteolysis. Eckardt et al. Plant Cell (2024, in press), in section Proteolysis and cell biology: The cell cycle, DNA damage response, and mitochondrial function:
- Genschik P & Noir S. FBL17: A proteolytic engine for the G1/S phase transition?
- Chen P, Heese M & Schnittger. A Is autophagy a key process in the plant DNA damage response?

Les dommages à l’ADN représentent une menace extrême pour chaque cellule de chaque organisme. Globalement, la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) consiste en une série d’évènements finement régulés depuis la détection du dommage subit, en passant par l’activation de la cascade de signalisation de la DDR, qui provoque également un blocage de la progression du cycle cellulaire, l’accumulation de facteurs de réparation de l’ADN aux sites de lésions, jusqu’à la réparation physique de l’ADN au niveau de ces sites et/ou le remplacement des cellules endommagées. De façon remarquable, les plantes, contrairement aux animaux, sont capables de supporter des concentrations très élevées d’agents nocifs. Cependant, malgré cette apparente faculté et leur importance en agriculture dans un contexte de changement climatique, les mécanismes de réparation de l’ADN chez les plantes restent mal connus. Par ailleurs, les voies de régulation canoniques décrites chez la levure et l’homme ne sont que partiellement conservées chez les plantes. Ceci amène à soulever les questions, comment les plantes parviennent elles à réparer aussi efficacement les dommages à l’ADN et, quels régulateurs sont impliqués dans ce processus.
Dans ce contexte, le travail préparatoire des 2 partenaires a mis en évidence un réseau DDR reposant sur la protéine homologue de pRb chez Arabidopsis, décrite sous le nom de RETINOBLASTOMA RELATED 1 (RBR1). RBR1 apparait jouer un rôle à au moins 2 niveaux : premièrement en tant que régulateur transcriptionnel de gènes DDR et deuxièmement, comme un potentiel facteur de recrutement de complexes de réparation aux sites de lésions. C’est pourquoi, RBR1 en tant que plateforme de contrôle dans la DDR, constitue un support central pour initier le développement des connaissances mécanistiques de la DDR chez les plantes.
Suite à l’identification en conditions de stress à l’ADN, des sites de liaison de RBR1 à l’échelle génomique et de son réseau d’interactions protéine-protéine à l’échelle protéomique, nous proposons de combiner les expertises complémentaires des 2 équipes pour élucider au niveau moléculaire, comment les cibles de RBR1 sont régulées lors de dommages à l’ADN et, d’explorer les fonctions jusque-là non décrites de ces gènes DDR cibles de RBR1. En parallèle, nous examinerons comment RBR1 est elle-même régulée en condition de stress à l’ADN. Les travaux antérieurs des 2 partenaires ayant révélé un rôle majeur des voies de dégradation protéolytique, à la fois dans la régulation fonctionnelle du complexe RBR1 et dans la régulation de ses gènes cibles, une importance particulière sera accordée à cet aspect. Dans cet objectif, nous suivrons l’hypothèse que la protéine F-box, FBL17, précédemment identifiée dans un travail collaboratif, joue un rôle clef dans l’homéostasie de RBR1 et pourrait aussi être impliquée dans la dégradation sélective des cibles de RBR1 associées aux dommages à l’ADN.