CE13 - Biologie cellulaire, biologie du développement et de l’évolution

Décrypter la base biophysique par laquelle les glycosaminoglycanes contrôlent la signalisation des facteurs de croissance pendant le développement : une approche biomimétique – GlyCON

GlyCON

Décrypter la base biophysique par laquelle les glycosaminoglycanes contrôlent la signalisation des facteurs de croissance pendant le développement : une approche biomimétique

contexte et objectifs

Au cours des dernières années, il a été de plus en plus prouvé que l'activité et la biodisponibilité des facteurs de croissance (FCs) dans les tissus est déterminée par la matrice extracellulaire, en particulier par les protéoglycanes porteurs de chaînes d'héparane sulfate (HS), qui se lient à des domaines précis trouvés sur les FCs. Néanmoins, la façon dont la structure des HS (profils de N- et O-sulfatations) et des sites de reconnaissance du polysaccharide sur les FCs (motifs d'acides aminés basiques) affectent l'interaction demeure très mal comprise à l'échelle moléculaire. Comme le sulfate de chondroïtine (CS), structurellement proche de l'HS, est le glycosaminoglycane le plus répandu dans les chondrocytes, nous avons émis l'hypothèse que le CS peut compenser le HS, au moins dans une certaine mesure. Notre objectif est de comprendre <br />1) comment le HS régule la bioactivité et la distribution des FC. <br />Nous étudions l'interaction de l'HS avec BMP2 et Ihh par des approches biophysiques et nous souhaitons intégrer nos résultats in vitro à des études biologiques (in vivo) des systèmes de signalisation au cours du développement du squelette. <br />2) comment la composition relative de HS et CS a un impact sur la bioactivité de la signalisation des FC. <br />En utilisant des approches biophysiques et biochimiques complémentaires, nous voulons étudier l'interaction de la BMP2 et de la Ihh avec le CS et analyser comment la composition relative du HS et du CS affecte l'activité biologique de ces FC en utilisant des plateformes biomimétiques et des analyses in vivo.

Pour caractériser la fonctionnalisation des plateformes biomimétiques, nous adoptons la microbalance à cristal de quartz avec contrôle de la dissipation (QCM-D), l'ellipsométrie spectroscopique (SE), la résonance plasmonique de surface (SPR) et la spectroscopie de corrélation d'image.
Les plateformes sont fonctionnalisées pas à pas par l'utilisateur ou automatiquement par un robot pipetteur.
Pour analyser les réponses cellulaires, nous avons adopté l'immunofluorescence, le western blot, la qPCR, la microscopie confocale, la coloration histologique et l'hybridation in situ.
Pour créer une bibliothèque d'oligosaccharides dérivés de HS avec un modèle de sulfatation contrôlé, nous utilisons la chromatographie d'exclusion de taille et la HPLC à échange d'anions forts. Les oligosaccharides obtenus sont biotinylés et leur liaison à la BMP2 est testée par des techniques de sensibilité de surface.

Des plateformes biomimétiques présentant des HS orientés avec BMP2 (aBMP2) ou aIhh adsorbés ont été développées. Ces plateformes ont été caractérisées par QCM-D et par SE pour quantifier la quantité de chaque composant.
Afin de concevoir des plateformes pour des études cellulaires, nous avons co-fonctionnalisé la couche de streptavidine avec le peptide d'adhésion cRGD et l'HS avec aBMP2 et Ihh. Pour faciliter le test de plusieurs conditions en parallèle, nous avons créé un protocole de pipetage automatisé qui est exécuté par un robot pipetteur à l'intérieur de plaques multi-puits. Un logiciel avec une interface utilisateur graphique a été développé pour piloter le robot. Pour cela, nous avons reprogrammé en langage VisualBasic une macro existante (Machillot et al 2018) pour traiter chaque puits de la plaque 96 puits avec différentes conditions. La distribution homogène des molécules a été évaluée par microscopie confocale et la densité surfacique des molécules analysée par spectroscopie de corrélation d'images.
Nous avons obtenu des fractions oligosaccharidiques d'HS de taille uniforme aprés digestion et chromatographie d'exclusion de taille. Les fractions dp4 et dp6 ont ensuite été fractionnées en fonction de la charge en utilisant une HPLC à échange d'anions forts, ce qui a permis d'obtenir différentes fractions avec un schéma de sulfatation distinct.
En collaboration avec UDE, nous avons étudié l'effet du HS extracellulaire versus celui de la surface cellulaire en plaçant des cellules déficientes en Ext1 (KO), la gycosyltransférase nécessaire à l'élongation de la chaîne HS, sur les plateformes biomimétiques. Nous avons observé que la forme cellulaire était significativement différente entre les cellules CHO WT et KO. Alors que les cellules WT se sont rapidement allongées et polarisées, les cellules KO sont restées rondes et ont développé des extrusion, ce qui indique que le HS de la surface cellulaire est nécessaire pour une adhésion et polarisation correcte

Au cours des 12 prochains mois, nous prévoyons de vérifier l'effet du HS de surface cellulaire par rapport au HS extracellulaire sur la signalisation BMP2 et l'adhésion cellulaire dans différents types de cellules tels que les fibroblastes embryonnaires de souris et les chondrocytes primaires. L'expression de la Ihh et de la BMP2 portant des mutations dans le site de liaison au HS sera réalisée à l'UDE et la liaison de ces protéines mutantes au HS sera réalisée au CEA. Pour comprendre le rôle de la sulfatation des HS sur la signalisation de la BMP2, nous finaliserons la bibliothèque de tétrasaccharides d'HS avec des sulfatations définies et réaliserons des études moléculaires et cellulaires. Les plateformes présentant des CS seront testées sur la signalisation BMP-SMAD et Ihh à différents moments. Plus vers la fin du projet, nous développerons des plateformes présentant un mélange de CS et de HS pour vérifier l'hypothèse de la compensation du CS au manque de HS. Pour cela, nous effectuerons des mesures QCM-D et SE pour quantifier la quantité de BMP2 et Ihh sur les différents mélanges de GAGs. Enfin, nous isolerons les GAGs des squelettes de souris E15.5 et de souris mutantes déficientes en HS. La digestion enzymatique spécifique des GAG (héparinases/Chondroïtinase ABC) permettra de déterminer la quantité relative de chaque GAG. La structure de sulfatation du HS et du CS sera étudiée à l'IBS. Afin d'avoir un premier aperçu de l'impact du mélange de GAGs physiologiquement pertinent sur l'affinité de Ihh et de BMP2. Les HS et CS isolés d'embryons normaux et des mutants seront biotinylés et immobilisés sur des plateformes SAv. L'interaction entre les GF isolés de cultures cellulaires eucaryotes et les GAGs immobilisés sera analysée par des tests ELISA utilisant des anticorps spécifiques de BMP2 et Ihh.

1.Sefkow-Werner J, Machillot P., Sales A., Castro-Ramirez E., Degardin M., Boturyn D., Cavalcanti-Adam A., Albiges-Rizo C., Picart C. and Migliorini E. Heparan sulfate co-immobilized with cRGD ligands and BMP2 on biomimetic platforms promotes BMP2-mediate d osteogenic differentiation. Acta Biomaterialia, 114:90-103, 2020.
2. Migliorini,E., Guevara-Garcia, A., Albiges-Rizo, C., and C. Picart. Learning from BMPs and their biophysical extracellular matrix microenvironment for biomaterial design. Bone 141 2020. 115540.
3.Khodr, V. Machillot, P., Reiser, JB, Migliorini, E. and C. Picart. High throughput measurements of bone morphogenetic protein (BMP)/BMP receptors interactions using bio-layer interferometry, Biointerphases 16, 031001 (2021).
4.Sales Ramos, A., Khodr, V., Machillot, P., Fourel, L., Migliorini, E., Albiges-Rizo, C, and Picart, C. Presentation of bone morphogenetic proteins to cells at their basal side reveals their specificity in the initiation of cell adhesion and bone differentiation. Submitted 1er mars 2021.
5.Sefkow-Werner J., Wang I, Picart C, Migliorini E, Delon A. Photobleaching and correlation spectroscopy for in situ quantification of multi-labelled molecules on surfaces. May 2021, European Conferences on Biomedical Optics (conference proceeding)
6. El Masri R, Seffouh A, Roelants C, Seffouh I, Gout E...Vivès R. Extracellular endosulfatase Sulf-2 harbours a chondroitin/dermatan sulfate chain that modulates its enzyme activity. Cell reports, in revision.

Au cours des dernières années, il a été de plus en plus prouvé que l'activité et la biodisponibilité des facteurs de croissance (FCs) dans les tissus est déterminée par la matrice extracellulaire, en particulier par les protéoglycanes porteurs de chaînes d'héparane sulfate (HS), qui se lient à des domaines précis trouvés sur les FCs. Néanmoins, la façon dont la structure des HS (profils de N- et O-sulfatations) et des sites de reconnaissance du polysaccharide sur les FCs (motifs d'acides aminés basiques) affectent l'interaction demeure très mal comprise à l'échelle moléculaire. De plus, la chondroïtine sulfate (CS), un glycosaminoglycane (GAG) dont la structure est similaire à celle des HS, se lie également à de nombreux FCs, bien qu’avec une affinité réduite. Les données préliminaires recueillies au sein du consortium ont montré des taux de CS plus élevés dans les chondrocytes de souris mutantes présentant une structure d’HS défectueuse, indiquant donc une fonction compensatoire des CS au moins dans les chondrocytes. La manière dont la composition des GAGs dans un tissu affecte l'activité des FCs n'a cependant pas été étudiée en détail. GlyCON est un projet multidisciplinaire reliant science des matériaux et la biologie du développement, dans le cadre duquel trois équipes internationales interagissent en étroite collaboration afin de recueillir des informations fondamentales sur les mécanismes par lesquels les HS et CS présentent, distribuent et activent des FCs. Basé sur l'expertise scientifique des partenaires, nous utiliserons le processus d'ossification endochondrale comme modèle d’étude des mécanismes moléculaires gouvernant l'interaction des HS et CS avec le FC Bone Morphogenetic Protein (BMP) et l'activité de signalisation du morphogène Indian hedgehog (Ihh). Dans notre approche multi-échelle, nous décrypterons les principes fondamentaux de la façon dont la structure des GAG détermine la bioactivité de ces FCs et comment les altérations de la structure des GAG affectent les processus de développement, l'homéostasie tissulaire et les maladies liées aux HS, comme les ostéochondromas multiples (MO) in vivo.
Plus précisément, nous nous proposons de créer une banque d'oligosaccharides d’HS présentant des profils de sulfatation distincts et de les immobiliser - avec la même orientation que pour les protéoglycanes in vivo - sur des plateformes biomimétiques. Ces plateformes seront développées pour des études biophysiques de l'affinité de liaison et de la stoechiométrie des interactions HS-BMP et HS-Ihh et pour l'étude biologique ultérieure de la façon dont la structure HS détermine la bioactivité du FC envers les cellules en co-culture. L'impact des modifications de la structure du HS sur l'homéostasie tissulaire sera étudié par des analyses in vivo sur des souris porteuses de mutations spécifiques des enzymes de synthèse des HS. Dans la deuxième partie, nous étudierons l'interaction biophysique des FCs avec les CS et déterminerons comment la composition relative des deux GAG (HS et CS) affecte la bioactivité des FCs in vitro en utilisant des cellules cultivées sur des plateformes biomimétiques, et in vivo sur des cellules primaires de souris mutantes.
Notre objectif final est d’acquérir des connaissances fondamentales sur les mécanismes gouvernant les interactions GAG – FCs, qui pourront alors être appliquées à l’étude d’autres FCs, tissues et maladies rares associés à la biosynthèse des GAGs, ouvrant ainsi la voie vers de nouvelles approches thérapeutiques.

Coordinateur du projet

Madame Elisa Migliorini (BRM - Biomimetism and Regenerative Medicine)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

BRM - Biomimetism and Regenerative Medicine BRM - Biomimetism and Regenerative Medicine
IBS Structure & Activités des Glycosaminoglycanes
UDE University Duisburg-Essen / Department of Developmental Biology, Faculty of Biology and Centre for Medical Biotechnology

Aide de l'ANR 253 871 euros
Début et durée du projet scientifique : janvier 2020 - 48 Mois

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