Les peptides antimicrobiens comme précurseurs des peptides d'adressage aux organites. – ChloroMitoRAMP

Ce projet original repose sur la combinaison d’approches bioinformatiques et computationnelles pour analyser l'histoire évolutive de l'importation des OTP et des mécanismes de résistance aux HA-RAMP avec des approches expérimentales réductionnistes biochimiques et génétiques. Ces dernières reposent sur la capacité unique de transformer en routine à la fois les génomes chloroplastique et nucléaire de C. reinhardtii et sur la puissance des outils de la microbiologie bactérienne. Placées à la lumière des facteurs de résistance bactériens HA-RAMP, nos analyses phylogénétiques inféreront des scénarios évolutifs plausibles pour l'origine de l'appareil de translocation et nous aideront à comprendre le «pourquoi» à travers leur histoire plutôt que le «comment» à travers leur fonction existante. De même, nous devrions également faire des avancées majeures sur le mécanisme mal connu «importer et détruire» des bactéries à la résistance à HA-RAMP, beaucoup moins étudié que ceux basés sur l'extrusion d'AMP dans le milieu externe, l'export de peptidases ou le remodelage de la teneur en phospholipides des membranes bactériennes. Les expériences de génétique et de biochimie permettront de tester ces hypothèses de travail.

Nous avons mis en place une classification de peptides courts ne partageant pas de similitude significative, basée sur la comparaison de leurs propriétés physico-chimiques en utilisant une régression linéaire plus stable que la regression des moindres carrés partiels. Nous avons ainsi confirmé la proximité physico-chimiques des oTP et HA-RAMP, et leur distance par rapport aux peptides signaux ciblant d'autres compartiments subcellulaires (Garrido et al., Cells, 2020). Sur la base de cette analyse, nous avons proposé une classification fonctionnelle et physico-chimique des HA-RAMP, classiquement classés jusqu'à présent en fonction de l'organisme à partir duquel ils sont isolées.
Nous avons confirmé les fonctionnalités croisées de ces peptides, en montrant que les TP synthétisés chimiquement présentent une activité antimicrobienne. Inversement, les HA-RAMP peuvent diriger un rapporteur fluorescent vers les mitochondries ou le chloroplaste dans l'algue modèle Chlamydomonas reinhardtii (Garrido et al., Cells, 2020)
Nous avons également reconstruit l'histoire évolutive des peptidases impliquées dans le clivage et la dégradation post-clivage des oTP (les signal-peptidase stromale et mitochondriale, SPP et MMP, la protéase de préséquence, PreP et l'OligoPeptidase organellaire, OOP) en construisant des arbres phylogénétiques de gènes robustes pour chaque peptidase. Nos résultats préliminaires montrent qu'au moins un événement de transfert horizontal à partir d'un génome bactérien explique l'origine de chaque peptidases, et que les homologues bactériens les plus proches de ces peptidases eucaryotes sont issus de bactéries résistantes aux peptides antimicrobiens, et de bactéries dont les ancêtres ont donné naissance à des chloroplastes et des mitochondries. Ces résultats confortent donc l'hypothèse d'une origine évolutive commune entre les peptidases dégradant les HA-RAMP et les peptidases dégradant les OTP.

Notre analyse bio-informatique nous a permis de distinguer les propriétés physico-chimiques clés distinguant les mTPs des cTPs, que nous avons ensuite exploitées pour déchiffrer les propriétés moléculaires nécessaires à un HA-RAMP pour cibler efficacement le chloroplaste ou les mitochondries. En utilisant plus de 200 constructions HA-RAMP-oTP chimériques contrôlant la localisation subcellulaire d'un rapporteur fluorescent chez Chlamydomonas, nous avons montré que les déterminants de spécificité responsables du ciblage vers les mitochondries ou le chloroplaste sont préexistants parmi les HA-RAMP naturels. Nous contribuons à l'effort en cours pour mieux comprendre ces déterminants de spécificité, montrant que le ciblage des chloroplastes nécessite des peptides plus longs et plus désordonnés qui devraient interagir avec les protéines via des motifs semi-conservées. Un article détaillant ces résultats est en préparation.
Des protocoles visant à tester la toxicité des peptides antimicrobiens ont été mis en place en utilisant différents milieux et conditions, qui permettront de tester des prédictions basées sur nos analyses phylogénomique. Les HA-RAMPs ou les oTPs sont susceptibles de perturber l'homéostasie de l'enveloppe cellulaire et les bactéries ciblées devraient développer une réponse adaptative. CpxR, un régulateur connu de détection de stress de l'enveloppe cellulaire a été étudié pour sa réponse et son effet sur l'homéostasie membranaire et en particulier la synthèse des phospholipides.

• Garrido C, Caspari OD, Choquet Y, Wollman F-A, Lafontaine I. 2020. “Evidence Supporting an Antimicrobial Origin of Targeting Peptides to Endosymbiotic Organelles”. Cells 9 (8): 1795.https://doi.org/10.3390/cells9081795.
• Caspari OD, Lafontaine I. (2021) The role of antimicrobial peptides in the evolution of endosymbiotic protein import. Plos Pathogen, in press
• Hassoun Y., Bartoli J., Wahl A., Viala J., Bouveret E. (2021) Dual regulation of phosphatidylserine decarboxylase expression by envelope stress responses. Minor revision

Il est largement admis que les mitochondries résultent de l'endosymbiose d'une ?-protéobactérie avec une archée ou un proto-eucaryote, il y a environ 2 Gy, alors que les plastes dérivent d'une endosymbiose ultérieure (~ 1,0-1,5 Gy environ) entre une cyanobactérie et un protiste prédateur. Ces endosymbioses ont été suivies d’un transfert massif de gènes des ancêtres des organites vers le noyau de la cellule hôte. La grande majorité du protéome des organites est maintenant codée par le noyau, traduite dans le cytosol et importée dans l'organite. Cet import repose sur des peptides d’adressage aux organites (oTP) (mitochondries, mTP ou chloroplaste, cTP) situés à l'extrémité N-terminale des protéines importées et permettant leur translocation à travers l'enveloppe des organites.
Comment les protéines importées ont acquis une séquence d’adressage aux organites et comment les ancêtres des organites ont acquis la machine d'importation correspondante reste énigmatique.
Pour survivre, le proto-endosymbiote a dû être capable de résister à l'immunité innée de la cellule hôte, qui inclut la production de peptides antimicrobiens amphiphiles hélicoïdaux (HA-RAMP), un mécanisme ancestral et universel de défense. Certaines bactéries soumises à l'action des HA-RAMPs de la cellule hôte ont développé divers mécanismes de résistance dont la capture des HA-RAMPs par des transporteurs bactériens, suivie de leur dégradation par des protéases bactériennes, récapitulant ainsi le mécanisme d’import des protéines dans les organites. Sur ces bases, nous avons proposé que ce mécanisme d’import soit issu de la cooptation d’un ancien mécanisme de résistance bactérienne aux HA-RAMPs.
Notre projet vise à tester les prédictions de cette hypothèse i) en recherchant des preuves évolutives du scénario proposé par la caractérisation des similitudes de séquence et de propriétés physico-chimiques des oTPs et des HA-RAMPs et en explorant les situations de type «pré-endosymbiotique» dans les génomes des protistes contemporains ii) en évaluant expérimentalement l'aptitude des HA-RAMP à diriger des protéines vers les organites ainsi que le potentiel antimicrobien des oTPs, tout en déterminant les résidus clés impliqués dans la transition évolutive d'une fonction à l'autre , iii) en disséquant les mécanismes moléculaires de la résistance bactérienne aux HA-RAMPs, comparés à ceux de l'importation de protéines dans les organites, et en déchiffrant l'histoire évolutive des translocons et des peptidases des organites, comparée à celle des transporteurs et peptidases impliqués dans la résistance bactérienne aux HA-RAMP
Ce projet ambitieux vise à un changement de paradigme en proposant une nouvelle vision des mécanismes d’import des protéines, un prérequis pour l'évolution des endosymbiotes vers les mitochondries et chloroplastes actuels. Il sera mis en œuvre par deux équipes de recherche aux compétences complémentaires, respectivement leaders en biologie des organites et en physiologie bactérienne. Il relie deux domaines scientifiques, la biogénèse des organites et la biologie des peptides antimicrobiens qui restent peu connectés malgré les preuves croissantes du rôle des peptides antimicrobiens pour le succès des symbioses contemporaines.
Au niveau appliqué, le transfert de voies métaboliques d'intérêt biotechnologique à de nouvelles espèces implique souvent le transfert de dizaines de gènes d'un organisme à un autre. La maitrise de l’import des protéines pour l’acquisition de nouvelles propriétés grâce à l'endosymbiose représente une nouvelle frontière de la biologie synthétique. Enfin, notre projet pourra éclairer les défauts du “nettoyage” protéolytique des peptides d’adressage conduisant à l’accumulation de peptides neurotoxiques dans les mitochondries des neurones cours de la maladie d’Alzheimer comme il pourra améliorer la compréhension de certains mécanismes mal connus de la résistance aux antimicrobiens, l’un des plus grands défis de santé publique mondiale.