CE13 - Biologie cellulaire, biologie du développement et de l’évolution

Réseaux de régulation régissant la diversité des muscles craniofaciaux – MyoHead

Regulatory networks governing craniofacial muscle diversity

Craniofacial malformations are among the most common human birth defects and have multiple etiologies that affect diverse tissues. The underlying genetic, developmental and clinical causes of these malformations are largely unknown. Therefore we aim to identify all of the cell types that give rise to craniofacial structures and the molecular regulators that lead to the establishment and morphogenesis of the various cell lineages in the head.

The upstream myogenic program in head and neck muscles is distinct from that operating in the trunk and limbs and converges on activation of myogenic determination factors of the MyoD family.

Branchiomeric muscles of the head and neck share a common origin in cardiopharyngeal mesoderm (CPM) with parts of the heart derived from second heart field cardiac progenitor cells. Clonal analysis has identified three common skeletal and cardiac muscle lineages along the anterior-posterior axis of the developing pharynx, giving rise to jaw opening muscles and the right ventricle, derived from the first branchial arch, facial expression muscles and the cardiac outflow tract, derived from the second arch, and neck muscles, including the trapezius, and venous pole myocardium from caudal arches. Investigation of the upstream CPM myogenic program operating in CPM reveals that while some CPM regulators, such as the transcription factor and 22q11.2 deletion syndrome gene TBX1, are broadly required, different regulatory subprograms operate in posterior and anterior arches.

Partners 1 and 2 contributed to the study of cranial mesoderm-derived striated muscles in the embryo by examining progenitor cell contribution to several structures including the esophagus, and extraocular muscles and trapezius muscle. Partner 1 also progressed towards establishing a 4D map of craniofacial muscle development by performing temporal scRNAseq analysis in the early mouse embryo using different genetic driver mice and different developmental stages. The 10X genomics platform was used with pipelines that were procured from the emerging literature or adapted in the lab (SCENIC, SEURAT, scVelo, etc.). Validations were done on cryostat sections at the appropriate stage using antibody staining and RNAscope.

Partner 1 identified bipotent progenitors expressing Myf5 that give rise to both muscle and juxtaposed connective tissue. Following this bifurcation, muscle and connective tissue cells retained complementary signalling features and maintained spatial proximity. Disrupting myogenic identity shifted muscle progenitors to a connective tissue fate.
Partner 1 showed that the transcription factors Tbx1 and Isl1 are required cell-autonomously for myogenic specification of ESM progenitors. Further, genetic loss-of-function and pharmacological studies point to MET/HGF signaling for antero-posterior migration of esophagus muscle progenitors, where Hgf ligand is expressed in adjacent smooth muscle cells (Comai et al. 2019).
Partner 1 also examined EOM formation in mouse. Partner 1 investigated the morphogenesis of EOMs, an evolutionary conserved cranial muscle group that is crucial for the coordinated movement of the eyeballs and for visual acuity. We redefined the cellular origins of periocular connective tissues interacting with the EOMs, which do not arise exclusively from neural crest mesenchyme as previously thought. Using 3D imaging approaches, we established an integrative blueprint for the EOM functional unit. Collectively, our results highlight how global and site-specific programs are deployed for the assembly of muscle functional units with precise definition of muscle shapes and topographical wiring of their tendon attachments.

Partner 2 discovered that the retinoic acid (RA) intercellular signaling pathway is required for myogenic fate acquisition in posterior cardiopharyngeal mesoderm. Blocking RA signaling during a defined early time window leads to venous pole cardiac septation defects (De Bono et al., 2018). Pharmacological inhibition of RA signaling during this developmental window also blocks development of the trapezius neck muscle anlagen. Camille Dumas (Myohead funded PhD student) has shown that RA is required for trapezius development upstream of activation of myogenic determination factors. While muscle fibers of the trapezius are CPM-derived, the connective tissue is derived from the somitic lineage. These results demonstrate that CPM derived muscles have somite derived connective tissue.
The phenotype of embryos in which the dominant negative RA receptor is activated using Pax3-Cre suggest that this leads to a striking and selective disruption of trapezius muscle development, in addition to craniofacial, including extraocular muscle, and cardiac defects. Detailed phenotyping of embryos where RA signal reception is blocked in the Pax3 lineage is underway. These results enabled us to draw up a new model by which RA signaling indirectly regulates trapezius development via signal reception in the Pax3 lineage. This model implicates a second signaling event, downstream of RA signal reception, from somitic mesoderm to CPM that would promote growth of the trapezius anlagen.

The MyoHead project exploits state-of-the-art genetic approaches, live imaging, and single cell transcriptomic studies to address these crucial questions. First, an unbiased genome-wide single-cell RNA-seq/ATACseq strategy will be used to define transcriptional hierarchies, regulatory enhancers, and developmental trajectories controling myogenic fates in CPM (Aim1). A spatiotemporal 4-D fate map of CPM contributions will be generated to define morphogenetic dynamics of head muscle formation (Aim2). This data will be combined with mouse genetic studies and ex vivo approaches to decipher the genetic mechanisms regulating head and neck myogenic fates in emerging CPM, and ontogenetic links with their postnatal derivatives (Aim3). MyoHead will synergise expertise of the Tajbakhsh (skeletal muscle regulatory hierarchies and stem cells) and Kelly (craniofacial and cardiac myogenesis) teams to investigate congenital pathologies of the head. We will leverage our preliminary scRNAseq data and extensive published and preliminary evidence from our groups to extend these studies and provide a high-resolution spatiotemporal roadmap of transcriptional diversity at the time of myogenic fate acquisition. By providing a mechanistic understanding of cell fate choices in the embryo and functional links with postnatal muscle stem cells (MuSCs), MyoHead will generate clinically relevant insights into the molecular defects underlying congenital craniofacial anomalies.

Grimaldi A, and S Tajbakhsh (2021). Diversity in cranial muscles: Origins and developmental programs. Curr. Opin. Cell Biol. Sep 6;73:110-116. doi: 10.1016/j.ceb.2021.06.005.

Grimaldi A, G Comai, S. Mella and S Tajbakhsh (2022). Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse. www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.05.26.445757v1. Elife. 2022 Feb 28;11:e70235. doi: 10.7554/eLife.70235.

Comai G*, Tesarova M, Dupé V, Rhinn M, Vallecillo Garcia P, da Silva F, Feret B, Exelby K, Dollé P, Carlsson L, Pryce B, Spitz F, Stricker, S, Zikmund T, Kaiser J, Briscoe J, Schedl, A Ghyselinck NB, Schweitzer R and Tajbakhsh S* (2020). Local retinoic acid directs emergence of the extraocular muscle functional unit. doi: doi.org/10.1101/2020.01.07.897694 *co-corresponding. PLOS Biology. 2020 Nov 17;18(11):e3000902. doi: 10.1371/journal.pbio.3000902.

Protocols for Investigating the Epithelial Properties of Cardiac Progenitor Cells in the Mouse Embryo.
Cortes C, De Bono C, Thellier C, Francou A, Kelly RG. Methods Mol Biol. 2022;2438:231-250. doi: 10.1007/978-1-0716-2035-9_15. PMID: 35147946

Emergence of heart and branchiomeric muscles in cardiopharyngeal mesoderm.
Lescroart F, Dumas CE, Adachi N, Kelly RG. Exp Cell Res. 2022 Jan 1;410(1):112931. doi: 10.1016/j.yexcr.2021.112931. Epub 2021 Nov 16. PMID: 34798131

Single cell multi-omic analysis identifies a Tbx1-dependent multilineage primed population in murine cardiopharyngeal mesoderm.
Nomaru H, Liu Y, De Bono C, Righelli D, Cirino A, Wang W, Song H, Racedo SE, Dantas AG, Zhang L, Cai CL, Angelini C, Christiaen L, Kelly RG, Baldini A, Zheng D, Morrow BE. Nat Commun. 2021 Nov 17;12(1):6645. doi: 10.1038/s41467-021-26966-6. PMID: 34789765

Over 60 oral presentations by members of the two labs where ANR MyoHead was cited, as well as meetings attended

Les malformations craniofaciales font partie des anomalies congénitales humaines les plus courantes et présentent plusieurs étiologies qui affectent divers tissus. Certains progrès ont été réalisés dans la compréhension de leur origine embryonnaire, mais les causes génétiques, développementales et cliniques restent inconnues. Les muscles squelettiques du corps et de la tête sont contrôlés par des facteurs de transcription distincts, démontrant ainsi une diversité inattendue dans les populations de cellules souches fondatrices qui établissent divers muscles. De plus, certains muscles ne succombent pas à la maladie, alors que d’autres sont affectés dans les myopathies. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que les régulateurs qui sont impliqués dans la mise en place des muscles pourraient donner des indices à la susceptibilité ou non des muscles à des maladies.

Contrairement au tronc où les lignées de muscles squelettiques proviennent du mésoderme paraxial, le mésoderme cardiopharyngé (CPM) contribue aux géniteurs des muscles striés craniofaciaux et des lignages du deuxième champ cardiaque. En outre, l'interface tête / tronc où des progéniteurs d'origine embryologique distincte établissent différentes masses musculaires, notamment celles du cou, de l'œsophage et du larynx, met en évidence l'ontogénie complexe de ce tissu. Plus précisément, les progéniteurs myogéniques squelettiques se séparent au sein du CPM pour donner naissance à des muscles branchiomériques impliqués dans la mastication, l'expression du visage, certains muscles du cou et des muscles extra-oculaires (EOM). Nos récentes études génétiques ont identifié de nouveaux dérivés myogéniques du CPM dans l'œsophage (ESM), le larynx (LSM) et le cou, une première étape dans l'établissement d'une feuille de route pour la morphogénèse cranofaciale. Cependant, où et quand les décisions sur le destin myogénique sont prises et où les voies de régulation conduisant à des destins divergents restent inconnues. Nous proposons de définir les réseaux de régulation des gènes, les lignées cellulaires et les événements morphogénétiques qui contrôlent l’émergence et le devenir des progéniteurs des muscles craniofaciaux, informations essentielles pour la compréhension de l’étiologie des anomalies congénitales craniofaciales. De manière significative, les cellules souches musculaires dérivées du crâne adultes ont un potentiel de croissance et de prise de greffe plus robustes que celles des membres. Nous avons défini des conditions qui distinguent ces propriétés et visons à identifier les mécanismes de régulation sous-jacents pour en éclairer les stratégies thérapeutiques. Nos résultats auront également des implications importantes pour disséquer le lien entre les anomalies congénitales craniofaciales et cardiovasculaires observées dans un certain nombre de syndromes génétiques.

Le projet MyoHead exploite des approches génétiques de pointe, une imagerie en direct et des études transcriptomique sur cellules uniques pour répondre à ces questions cruciales. Premièrement, des experiences de RNAseq / ATACseq, à l'échelle du génome, sera utilisée pour définir les hiérarchies transcriptionnelles, les activateurs de la régulation et les trajectoires de développement contrôlant les destins myogéniques dans le CPM (Objectif 1). Une carte spatio-temporelle en 4-D du devenir des contributions du CPM sera générée pour définir la dynamique morphogénétique de la formation du muscle de la tête (Objectif 2). Ces données seront combinées à des études génétiques sur des souris et à des approches ex vivo pour décrypter les mécanismes génétiques régulant le destin myogénique de la tête, ainsi que des liens ontogénétiques avec leurs dérivés postnatals (Objectif 3). MyoHead mettra en synergie l’expertise des équipes Tajbakhsh (hiérarchies régulatrices du muscle squelettique et cellules souches) et Kelly (myogenèse craniofaciale et cardiaque) afin d’examiner les pathologies congénitales de la tête.

Coordination du projet

Shahragim Tajbakhsh (INSTITUT PASTEUR)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.


CNRS DR12_IBDM Centre National de la Recherche Scientifique Délégation Provence et Corse _Institut de Biologie du Développement de Marseille

Aide de l'ANR 460 430 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2019 - 36 Mois

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