CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonction des macromolécules biologiques

Rhodopsines virales: Structure, Fonction, et Nouveaux Outils pour l'Optogénétique – Viral_Rhodopsins

Nouvelles protéines sensibles à la lumière provenant de virus

Les protéines activées par la lumière de la famille des rhodopsines, présentes dans les 3 domaines du vivant, ont également été trouvées dans le génome de virus géants. On sait peu sur ces rhodopsines de virus. Leur structure, organisation oligomérique et fonction sont inconnues. Quoique similaires, les rhodopsines virales diffèrent grandement des rhodopsines connues. Ces protéines pourraient révéler de nouveaux mécanismes biologiques et soutenir des applications possibles en optogénétique.

Elucider la structure et la fonction des rhodopsines virales, et examiner la possibilité d'utiliser ces protéines comme régulateurs actionnés par la lumière dans les tissus mammifères.

Les virus géants ont des génomes et des tailles comparables à ceux de certaines bactéries. Des gènes de rhodopsines ont été identifiés dans des virus géants qui infectent une algue du lac Organic, en Antarctique. On sait que cette algue est une source majeure de sulfure de diméthyle, substance essentielle qui influence l'écologie et le climat sur Terre. Il est donc pertinent d'étudier les rhodopsines virales car leur fonction pourrait fournir des indices sur leur rôle dans l'infection. <br />Les rhodopsines virales sont classées en deux groupes. Nous travaillons sur OLPVRII, un représentant du groupe II, et également sur OLPVRI, un représentant du groupe I. Les gènes correspondants OLPVR1 et OLPVR2 proviennent du même virus géant, mais sont différents l'un de l'autre et des autres rhodopsines. <br />Nos objectifs sont de réaliser une caractérisation structurale des rhodopsines virales et de mutants conçus rationnellement, de valider expérimentalement leur fonction et d'étudier leur potentiel en tant qu'outils optogénétiques de prochaine génération. Le consortium est prêt à appliquer son expertise multidisciplinaire complémentaire en matière de production de protéines, de détermination de la structure, de caractérisation biophysique, de conception rationnelle et d'application dans le domaine des neurosciences, afin de proposer un ensemble de protéines pilotées par la lumière pour l'optogénétique.

Caractérisation structurale :
1. Production de protéines, caractérisation fonctionnelle in vitro par des méthodes spectroscopiques, y compris la détermination du photocycle par photolyse flash, et imagerie de molécules uniques.
2. Cristallisation et études structurales des protéines dans les états fondamentaux et intermédiaires des protéines. Nous utiliserons la cristallographie complémentaire aux rayons X, y compris la cristallographie à résolution temporelle avec des sources de rayons X synchrotron et XFEL et la cryo-EM dans le cas de protéines oligomériques.
Caractérisation fonctionnelle :
1. Les rhodopsines virales seront exprimées dans des ovocytes de Xenopus et caractérisées en termes de dépendance et de sélectivité vis-à-vis de la lumière à l'aide de la technique du patch clamp à canal unique et d'enregistrements par microélectrodes sur cellules entières. Comme les canaux membranaires bactériens et viraux s'expriment souvent mal au niveau de la membrane plasmique, il sera probablement nécessaire d'ajouter des séquences de signalisation ou de coexprimer des protéines chaperonnes pour favoriser le trafic membranaire.
2. Caractérisation fonctionnelle in vivo des protéines pilotées par la lumière, y compris leur activité dans les cellules neuronales. Les protéines virales seront d'abord exprimées dans des cellules de mammifères, puis dans des cultures de neurones et dans des tranches d'hippocampe. Les propriétés électrophysiologiques de chaque protéine, ainsi que sa capacité à moduler l'activité neuronale, seront évaluées et comparées aux outils optogénétiques et optopharmacogénétiques existants.

La structure à ultra-haute résolution de OLPVR1 à 1,4 Å a été obtenue par christallographie aux rayons X.
Plusieurs rhodopsines virales ont été exprimées dans l'ovocyte de xénope. La fonction d'OLPVR1 a été étudiée en détail et s'est avérée unique parmi toutes les rhodopsines étudiées à ce jour.
OLPVR1 a été exprimée dans des cellules HEK293 de mammifères et sa fonction a été confirmée.
Une construction lentivirale incorporant OLPVR1 a été conçue pour l'expression et la caractérisation dans les tissus natifs.

Les résultats devraient founrir des informations sur le rôle des rhodopsines virales dans l'infection de l'hôte et pourraient constituer la base de nouveaux outils pour les applications optogénétiques.

Zabelskii, D., Alekseev, A., Kovalev, K., Rankovic, V., Balandin, T., Soloviov, D., Bratanov, D., Savelyeva, E., Podolyak, E., Volkov, D., Vaganova, S., Astashkin, R., Chizhov, I., Yutin, N., Rulev, M., Popov, A., Eria-Oliveira, A.S., Rokitskaya, T., Mager, T., Antonenko, Y., Rosselli, R., Armeev, G., Shaitan, K., Vivaudou, M., Büldt, G., Rogachev, A., Rodriguez-Valera, F., Kirpichnikov, M., Moser, T., Offenhäusser, A., Willbold, D., Koonin, E., Bamberg, E. and Gordeliy, V., 2020, Viral rhodopsins 1 are an unique family of light-gated cation channels, Nat. Commun. 11: 5707.
Ávalos Prado P, Landra-Willm A, Verkest C, Ribera A Chassot AA, Baron A and Sandoz G. TREK channel activation suppresses migraine pain phenotype. iScience. (sous presse)
Demande de brevet en préparation.

--- CONTEXTE ---
Les protéines activées par la lumière de la famille des rhodopsines, présentes dans les trois domaines de la vie, se sont également avérées être codées par des virus, en l’occurrence des virus géants. On sait peu de choses sur ces rhodopsines virales et sur leur rôle possible dans l'infection virale. Leur structure, leur organisation oligomérique et leur fonction en termes de transport et de substrats sont inconnus. Malgré la similarité de leurs séquences protéiques, nous disposons de suffisamment de données préliminaires pour montrer que les rhodopsines virales diffèrent grandement des rhodopsines connues car elles peuvent s'assembler en complexes, qui ressemblent aux canaux ioniques pentamériques activés par les neurotransmetteurs trouvés chez l’homme, avec comme agoniste la lumière. Ces protéines pourraient donc impliquer de nouveaux mécanismes biologiques et servir de socle à de nouvelles applications en optogénétique.

--- OBJECTIFS ---
Notre ambition est de déchiffrer la structure et la fonction des rhodopsines virales et d'examiner la possibilité d'utiliser ces protéines comme actuateurs photosensibles dans les tissus eucaryotes. Nos résultats devraient contribuer à comprendre le rôle des rhodopsines virales dans l'infection et la réplication, et pourraient constituer la base de nouveaux outils pour l’optogénétique.

--- CONSORTIUM ---
Le consortium regroupe trois partenaires ayant des expertises complémentaires dans les domaines de la biologie structurale (IBS-Membrane, Institut de biologie structurale, Grenoble), de l'électrophysiologie dans les cellules modèles (IBS-Channels, Institut de biologie structurale, Grenoble), et de l'électrophysiologie et de l'optogénétique dans les cellules natives mammifères (iBV, Institut de Biologie Valrose, Nice).

--- PROGAMME DE TRAVAIL ---
Les rhodopsines virales sont séparées en deux groupes phylogénétiques. Nous travaillerons avec des représentants de chaque groupe, OLPVRI et OLPVRII.
Le partenaire IBS-Membrane effectuera la caractérisation structurelle d'OLPVRI et d'OLPVRII dans leurs différents états conformationnels par cristallographie aux rayons X, cristallographie sérielle résolue dans le temps et cryo-microscopie électronique, à l'aide de grands instruments européens (synchrotron de Grenoble, laser à électrons libres de Hambourg et microscope Titan Krios de Grenoble). Le partenaire effectuera également une caractérisation fonctionnelle in vitro des protéines.
En parallèle, le partenaire IBS-Channels caractérisera la fonction des rhodopsines virales dans des cellules modèles et optimisera leurs propriétés par ingénierie de protéines guidée par les données structurales.
Le partenaire iBV testera le potentiel optogénétique des protéines dans des cellules neuronales et des tranches de cerveau.

Les tâches proposées sont extrêmement difficiles. Toutefois, la faisabilité du projet est confirmée par des données préliminaires solides et l’expérience réussie des partenaires dans les domaines scientifiques et méthodologiques correspondants. En particulier, une structure à haute résolution d'OLPVRII dans l'état de base a déjà été obtenue et une caractérisation fonctionnelle de l'OLPVRI a été initiée.

Coordinateur du projet

Monsieur Michel Vivaudou (INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

iBV Institut de biologie de Valrose
IBS-Membrane INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE
IBS-Channels INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE

Aide de l'ANR 591 380 euros
Début et durée du projet scientifique : novembre 2019 - 48 Mois

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