CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonction des macromolécules biologiques

Nanosondes pour l'imagerie des synapses en microscopie de super-résolution – NanoPROBE

Résumé de soumission

Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la majorité des processus cellulaires ont lieu à l’échelle nanométrique. Le développement de la microscopie de super-résolution dans les dix dernières années, a été récompensée par le prix Nobel de chimie en 2014, et permet d’étudier ces mécanismes avec une grande précision, dans des systèmes vivants. Ces nouvelles méthodes comblent l’écart entre la microscopie électronique, qui offre une résolution nanométrique mais dans des échantillons fixés, et la microscopie à fluorescence classique dont la résolution est intrinsèquement limitée à ~250 nm par la diffraction de la lumière. Ces méthodes ont ainsi permis la découverte de structures biologiques nouvelles et l’émergence de concepts fondamentaux, qui permettent de mieux comprendre l’organisation discrète des ensembles macromoléculaires sous-tendant les fonctions cellulaires. Dans le cadre particulier de la transmission de l’information dans le cerveau, où les contacts cellulaires sont établis dans des environnements extrêmement confinés, denses, et restreints à ~20 nm x 250-500 nm, la microscopie de super-résolution ouvre de nouvelles perspectives quant à l’étude de ces nano-environnements, dans le but de mieux comprendre la base de la connectivité neuronale et sa modulation au cours de la vie d’un individu. Cependant, comme toutes les techniques émergentes, elle a révélé d’importantes limitations. Alors que les microscopes optiques sont sans cesse optimisés et permettent l’accès à des résolutions d’à peine quelques nanomètres (~ 10 nm), les outils de biologie cellulaire permettant de marquer spécifiquement les protéines n’ont pas évolué. Ainsi, l’utilisation d’outils traditionnels comme les anticorps divalents, dont la taille est d’environ 15 nm * 2 (primaire/secondaire), va à l’encontre des développements optiques. Développer des outils performants pour le ciblage des protéines est donc devenu une nécessité pour la bio-imagerie et la biologie cellulaire en général, afin de pouvoir bénéficier pleinement des résolutions optiques des nouveaux microscopes pour étudier les phénomènes cellulaires avec la plus grande précision possible.
Ce projet consistera donc à :
- Développer des sondes monomériques et versatiles de 3 nm (nanosondes) pour bénéficier pleinement des résolutions disponibles
- Fonctionnaliser et caractériser ces nanosondes pour la microscopie de super-résolution et le marquage des protéines dans les tissus vivants
- Utiliser les nouvelles nanosondes pour étudier l’organisation dynamique des adhésions synaptiques
Pour le développement des sondes, des banques de domaines protéiques (~ 10 kDa) génétiquement diversifiés par évolution dirigée seront criblées afin d’isoler des variants affins pour des épitopes spécifiques et des protéines endogènes impliquées dans des pathologies neuro-développementales sévères (troubles du spectre de l'autisme, schizophrénie, épilepsie). Ces outils versatiles ou ciblés, permettront d’étudier la spécification et la modulation de la connectivité neuronale. Ils seront conjugués à des fluorophores performants pour la microscopie de super-résolution, 3D et quantitative, et le marquage des tissus, ainsi qu’à des oligonucléotides pour l’imagerie de type DNA-PAINT. L’utilisation des nouvelles nanosondes pour cibler les protéines synaptiques dans les tissus nous permettra d’élucider pour la première fois l’organisation interne de ces structures avec une grande précision pour cartographier les connexions neuronales à l’échelle nanométrique et comprendre l'impact de certaines mutations génétiques sur cette organisation. Ce projet a donc pour ambition de lever deux verrous majeurs, le premier en neurosciences fondamentales, en permettant la visualisation des adhésions synaptiques dans les tissus vivants, et le deuxième en bio-imagerie, en apportant des outils performants pour le ciblage des protéines en microscopie de super-résolution et en profondeur.

Coordination du projet

Ingrid CHAMMA (INSTITUT INTERDISCIPLINAIRE DE NEUROSCIENCES)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IINS INSTITUT INTERDISCIPLINAIRE DE NEUROSCIENCES

Aide de l'ANR 300 169 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2019 - 48 Mois

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