Caractérisation des machineries de réplication de Bunyavirus hautement pathogènes par une approche de biologie structurale intégrée – HiPathBunya

Les Bunyavirales constituent un large ordre de virus à ARN négatif segmenté comprenant plus de 500 virus classifiés en 10 familles. Retrouvés partout sur la planète, ces virus ont pour réservoir des arthropodes et des rongeurs et sont susceptibles d’infecter l’homme résultant en des maladies de forte gravité comme des méningites, des encéphalites ou encore des fièvres hémorragiques. Ces virus connaissent actuellement une expansion géographique notamment en Europe : ainsi le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV) a récemment provoqué des épidémies en Grèce, Turquie et Espagne. La future expansion géographique de certains de ces agents infectieux due aux changements climatiques est une menace potentielle, ce qui souligne l’importance des recherches visant à comprendre le fonctionnement de ces virus et de développer des antiviraux pour les contrôler.
Dans ce contexte, nous proposons dans le projet HiPathBunya de comprendre deux étapes essentielles du cycle viral : la réplication, qui vise à dupliquer le génome viral, et la transcription, qui permet la synthèse d’ARN messagers viraux aptes à d’être traduits en protéines virales. Ces relations sont catalysées par l’ARN-polymérase virale qui interagit avec les extrémités 3’ et 5’ de l’ARN viral et avec des nucléoprotéines (notées NPs) pour former une ribonucléoprotéine (RNP) qui est l’unité structurelle de la transcription et de la réplication.
Afin de comprendre en détail les mécanismes impliqués dans la synthèse d’ARN viral, nous proposons une étude structurale et fonctionnelle intégrative de la machinerie réplicative de deux bunyavirus hautement pathogènes : le virus Hantaan (Hantavirus) et le virus CCHFV (Nairovirus).
Nous chercherons tout d’abord à comprendre comment la structure et la dynamique de la polymérase permettent de réaliser toutes les activités nécessaires à la réplication et la transcription. Pour cela, nous proposons de déterminer la structure des ARN-polymérases des virus CCHFV et Hantaan par cristallographie et cryo-microscopie électronique. Ces structures devraient être entièrement nouvelles et sont susceptibles de révéler des domaines de fonctions inconnues, permettant ainsi de lever le voile sur des aspects ignorés de la réplication. Puis, nous analyserons le mode de liaison entre polymérase et promoteurs et dériverons une analyse biochimique détaillée des réactions de réplication et transcription. Ceci permettra une analyse structurale dans différents états fonctionnels visant à obtenir un film 3D des changements de conformations de ces enzymes en action.
Nous chercherons ensuite à analyser la réplication dans le contexte fonctionnel des RNP en utilisant une approche multi-échelle. Nous avons recemment déterminé une structure à haute résolution de nucléocapsides hélicoïdales recombinantes du virus par cryo-microscopie électronique. Nous poursuivrons ces analyses afin de visualiser la position de l’ARN au sein de ces nucléocapsides. Des études supplémentaires sur l’interaction avec la protéine L seront menées afin de comprendre comment la protéine L accède à la matrice d’ARN. Notre vision intégrée de la réplication des Hantavirus sera complétée par l’analyse par immunofluorescence de cellules infectées et microscopie électronique de coupes cellulaires afin de comprendre l’organisation des RNPs in vivo.
Enfin, nous tenterons de définir la dynamique des protéines L lors de la transcription et de la réplication par la microscopie à force atomique à haute vitesse, y compris les facteurs cellulaires qui pourraient être essentiels pour les fonctions de la RNP.
La mise en commun de ces approches permettra de dériver un modèle mécanistique basé sur la structure afin d’expliquer comment les virus à ARN négatif segmenté réalisent la réplication et la transcription. Ces recherches auront de plus un impact crucial pour le développement d’antiviraux à large spectre.