CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonction des macromolécules biologiques

Dissection du mécanisme moléculaire d'un transporteur d'antibiotiques – BIOTIFLUX

Dissection du mécanisme moléculaire d'un transporteur d'antibiotiques

La résistance aux antibiotique est une menace pour la santé humaine, and les pompes à efflux contribuent à ce phénomène. Un nombre croissant de transporteurs ABC bactériens, qui utilisent l'énergie d'hydrolyse de l'ATP pour transporter les drogues, sont impliqués dans les mécanismes de résistance à de multiples drogues.

Le mécanisme des transporteurs ABC de multiples drogues reste peu connu et nous proposons d'élucider le mécanisme moléculaire d'une de ces pompes chez Bacillus subtilis, BmrA

Notre consortium a trois objectifs majeurs. Le premier est de déterminer la structure de BmrA dans plusieurs conformations, par cryo-microscopie électronique et cristallographie aux rayons X. Le second est d'étudier la dynamique conformationnelle de BmrA par 3 techniques: l'échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse, la spectroscopie RPE et la RMN en phase solide. Le troisième est de comprendre comment l'activité ATPase est couplée au transport de drogues. Pour cet objectif, nous allons caractériser biochimiquement et structuralement des mutants découplés qui hydrolysent l'ATP mais qui ne parviennent pas ou mal à transporter les drogues.

cryo-microscopie électronique, cristallographie aux rayons X, activités d'hydrolyse de l'ATP et de transport de drogues, échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse, la spectroscopie RPE et la RMN en phase solide

Nous avons résolu des structures de BmrA en complex aved de l'ATP-Mg2+ et de la rhodamine 6G par cryo-microscopie électronique et cristallographie aux rayons X. Nous avons reconstitué BmrA en nanodisques et étudié sa dynamique conformationnelle par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX). Nous avons pu observer les changements conformationnels de BmrA au cours de différentes étapes du cycle catalytique: apo (sans ligand), état de transition (ADP-Mg2+-Vi) et fixé avec une drogue (doxorubicin). Ces résultats nous ont permis d'identifier: (i) les régions flexibles des domaines transmembranaires dans la conformation ouverte vers l'extérieur (ii) les acides aminés importants dans la communication entre les domaines de fixations des nucléotides et les domaines transmembranaires (iii) les régions de la protéine qui répondent à la fixation de doxorubicine. Enfin, nous avons étudiés comment différents analogues de l'ATP peuvent être utilisés pour l'étude structurale de BmrA.

Nous continuons à acquérir des données structurales, biochimiques et biophysiques sur les étapes clefs du mécanisme de transport de BmrA. In fine, ces données nous permettrons de comprendre la transition allostérique pendant les étapes de fixation d'ATP et de drogues, ainsi que pendant la transition entre les conformations ouvertes vers l'intérieur ou l'extérieur.

1. Structures of ABC transporters: handle with care. Oded Lewinson, Cédric Orelle and Markus A. Seeger. FEBS let. (2020), 594(23):3799-3814.

2. ATP Analogues for Structural Investigations: Case Studies of a DnaB Helicase and an ABC Transporter. Denis Lacabanne, Thomas Wiegand, Nino Wili, Maria I Kozlova, Riccardo Cadalbert, Daniel Klose, Armen Y Mulkidjania, Beat H Meier and Anja Böckmann. Molecules (2020);25(22):5268.

3. Identification of novel inhibitors of the ABC transporter BmrA. Onur Serçinoglu, Duygu Senturk, Fatma E. Altinisik Kaya, Fatma Gizem Avci, Rok Frlan, Tihomir Tomašic, Pemra Ozbek, Cédric Orelle, Jean-Michel Jault and Berna Sariyar Akbulut. Bioorg Chem (2020);105:104452.

4. Functional overexpression of membrane proteins in E. coli: the good, the bad and the ugly. Margot Di Cesare, Aissatou Maty Diagne, Benjamin Bourgey, Jean-Michel Jault and Cédric Orelle. Methods Mol. Biol. (2021); in press.

La résistance aux antibiotiques est une menace de santé publique de plus en plus sérieuse. Cela représente un challenge difficile, notamment à cause de l’émergence de résistance à de multiples drogues, lorsque des bactéries deviennent résistantes à de nombreuses drogues aux structures ou fonctions non apparentées. Les pompes à efflux contribuent à ce phénomène et peuvent favoriser une adaptation bactérienne ainsi que l’acquisition d’autres mécanismes de résistance. Un nombre croissant de transporteurs ABC, qui utilisent l’énergie d’hydrolyse de l’ATP pour expulser les drogues et antibiotiques, est impliqué dans ces phénomènes. Parce que leur mécanisme de fonctionnement est encore mal connu, nous proposons de décrypter le mécanisme moléculaire d’une de ces pompes, BmrA de Bacillus subtilis, en utilisant une combinaison d’approches structurales et dynamiques.

Coordination du projet

Cédric ORELLE (Microbiologie Moléculaire et Biochimie Structurale)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

MMSB Microbiologie Moléculaire et Biochimie Structurale
CNRS DR12_BIP Centre National de la Recherche Scientifique Délégation Provence et Corse_Bioénergétique et ingénierie des protéines
MMSB Microbiologie Moléculaire et Biochimie Structurale
MMSB Microbiologie Moléculaire et Biochimie Structurale

Aide de l'ANR 623 916 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2019 - 42 Mois

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