Spectrométrie de masse structurale pour étudier le dialogue entre les mécanismes de régulation des complexes du protéasome – ProteasoRegMS

Dans ce projet, les complexes de protéasomes sont analysés soit directement à partir de lysats cellulaires, soit après immunopurification avec un anticorps qui reconnaît la sous-unité alpha2 (présente dans tous les types de protéasomes). Les interactions avec des partenaires potentiels peuvent être stabilisées par réticulation réversible au formaldéhyde.
Nous utilisons la protéomique bottom-up pour l'identification et la quantification à grande échelle des protéines présentes dans les échantillons. Des tests statistiques sont ensuite utilisés pour mettre en évidence quelles protéines sont sur- ou sous-régulées dans un échantillon ou une condition.
La protéomique top-down est utilisée pour déterminer avec précision et semi-quantifier les protéoformes de la particule 20S.
Nous utilisons l'échange hydrogène-deutérium couplé à la spectrométrie de masse, pour sonder la dynamique et l'accessibilité au solvant des régulateurs / partenaires du protéasome 20S et pour identifier les régions stabilisées ou déstabilisées lors d'une interaction avec les régulateurs / partenaires / médicaments ou lors du remplacement des sous-unités catalytiques.
Le criblage de drogues utilise un test enzymatique basé sur des peptides fluorogènes ainsi que la fluorimétrie différentielle à balayage.

Nous avons établi la faisabilité de l'approche du WP1 dans des cellules Caco2, en montrant la surexpression des sous-unités immuno-catalytiques du protéasome lors de la stimulation par l'interféron-gamma. Nous n'avons observé aucune induction d'immunoprotéasome avec les autres cytokines testées.
Le WP2 est presque terminé et les résultats obtenus ont été publiés fin 2020 dans Nature Communications. Dans ce travail, nous décrivons pour la première fois l'utilisation de l'HDX-MS pour étudier les complexes du protéasome. En comparant les données obtenues sur des protéasomes contenant différentes sous-unités catalytiques (std20S vs i20S), nous avons mis en évidence de fines perturbations intramoléculaires à partir de ces sous-unités et atteignant progressivement la surface du complexe. Ces résultats expliquent comment l'introduction d'une isoforme différente dans le complexe peut favoriser l'interaction avec des régulateurs spécifiques. Par ailleurs, la comparaison de ces protéasomes avec ou sans régulateur a permis de mettre en évidence un mécanisme de régulation inverse, dans lequel le contact d'un régulateur à la surface du protéasome se propage vers les sites catalytiques. En plus de révéler des aspects clés sur la régulation allostérique du protéasome 20S, cet article jette les bases de l'analyse HDX-MS des complexes 20S. Nous avons profité de cette expertise pour étudier un autre sous-type de protéasome: le spermatoprotéasome qui est spécifiquement exprimé dans les cellules germinales. L'analyse HDX-MS a révélé des différences de dynamique entre le C-ter des sous-unités a4/a4s, confirmées par des simulations de dynamique moléculaire. Nous avons également étudié l'avantages de l'utilisation de la mobilité ionique couplée à l'HDX-MS afin d'obtenir de meilleures couvertures de séquence sur le protéasome 20S.
Les std20S et i20S ont été immunopurifiés à partir de cellules HEK pour mettre en place une nouvelle façon de quantifier les protéoformes du 20S par Top-Down MS.

Principales découvertes:
• Mise en place des conditions méthodologiques pour l'analyse protéomique bottom-up et top-down des interacteurs du protéasome à partir de cellules Caco2, permettant une analyse plus approfondie d'échantillons provenant de patients atteints de MICI.
• Première analyse HDX-MS des protéasomes std20S et i20S seuls et en complexe avec les régulateurs PA28aß ou PA28gamma (Lesne et al, 2020 Nature Communications).
• Comparaison par HDX-MS du std20S et du spermatoprotéasome (Zivkovic et al, en préparation).
• Semi-quantification Top-Down MS des protéoformes du protéasome 20S (Dafun Sanchez et al, en préparation, a).
• Revue sur l'analyse par MS structurale de protéines membranaires (Dafun Sanchez et Marcoux, 2021 BBA Proteins and Proteomics, en révision) et article de vulgarisation sur la MS structurale (Marcoux, 2021 L'actualité Chimique).
• Utilisation de la mobilité ionique MS pour augmenter la couverture de séquence de grands complexes multiprotéiques dans les analyses d'HDX-MS (Dafun Sanchez et al, en préparation, b)

Perspectives:
WP1: Nous sommes maintenant prêts à commencer à travailler sur des lysats cellulaires obtenus à partir de biopsies et d'organoïdes issus de patients atteints de MICI qui seront bientôt fournis par notre collaborateur.
WP2: La dernière expérience, consistant en l'analyse par HDX-MS des Protéasomes Interacting Proteins (PIP: IDE et PIP30) ne devrait pas poser de problème, puisque la preuve de concept sur le protéasome est désormais établie.
Le WP3 n'a pas encore démarré et est toujours programmé à la fin de ce projet. L'analyse HDX-MS du protéasome 20S avec et sans inhibiteurs, sera menée conjointement avec l'analyse des PIP et bénéficiera également de notre expertise acquise. Le criblage enzymatique et le criblage par fluorimétrie différentielle à balayage des drogues seront réalisés respectivement à la mi et à la fin 2022.

Articles:
1. Lesne J*, Locard-Paulet M*, Parra J, Zivkovic D, Menneteau T, Bousquet MP, Burlet-Schiltz O, Marcoux J (2020) “Conformational maps of human 20S proteasomes reveal PA28- and immuno-dependant inter-ring crosstalks” Nature Communications 11(1):6140.
2. Sanchez Dafun A and Marcoux J (2021) “Structural Mass Spectrometry of Membrane Proteins” BBA Proteins and Proteomics In Revision
3. Marcoux J (2021) “Peser le protéasome pour sonder sa structure” L’Actualité Chimique In Revision
4. Zivkovic D, Sanchez Dafun A, Lise S, Menneteau T, Toste-Rêgo A, Da Fonseca P, Pineau C, Burlet-Schiltz O, Marcoux J*, Bousquet-Dubouch MP* (2021) “Structural and functional study of the proteasome complexes in spermatogenesis using modern mass spectrometry approaches” In Preparation

Présentations Orales:
1. “Hydrogen-deuterium eXchange coupled to Mass Spectrometry highlights a reciprocal crosstalk between the inner and outer rings of the 20S proteasome”, Symposium on Structural Proteomics, Göttingen, Germany, 11/2019
2. “Study of the largest and most heterogeneous macromolecular complex by HDX-MS: bringing new important mechanistic insights in proteasome regulation”, Albert Heck FAQ Meeting, Utrecht, The Netherlands (webinar), 01/2021
3. “Structural MS in Proteomics”, British Mass Spectrometry Society – Virtual Biomacromolecular Structure Special Interest Group, United Kingdom, 03/2021
4. “Study of the largest and most heterogeneous macromolecular complex by HDX-MS: bringing new important mechanistic insights in proteasome regulation”, SMAP 2019, Strasbourg, 09/2019
5. “Hydrogen-deuterium eXchange coupled to Mass Spectrometry highlights a reciprocal crosstalk between the inner and outer rings of the 20S proteasome” Integrative Structural Biology, Toulouse, France, 10/2019
6. “Study of the largest and most heterogeneous macromolecular complex by HDX-MS: bringing new important mechanistic insights in proteasome regulation”, Centre de Biologie Structurale, Montpellier, 01/2020

Contexte:
Le protéasome est un complexe multiprotéique très conservé mais très hétérogène au niveau structural et fonctionnel. Sa fonction principale, à travers le système ubiquitine-protéasome est d'assurer le recyclage des protéines intracellulaires, mais d'autres fonctions spécifiques, telle que la génération de peptides fonctionnels ont récemment été décrites, résultant de l'association avec différents régulateurs (19S, PA28aß, PA28?, PA200). Sa dérégulation peut être cytotoxique et est associée à diverses maladies neurodégénératives et cancers. On peut distinguer trois voies de régulation de son activité protéolytique: l'interaction du cœur catalytique 20S avec des régulateurs dédiés, le remplacement des sous-unités catalytiques (ß1, ß2 et ß5) standard (Std) par des sous-unités inductibles formant l'immunoprotéasome (i20S) lors de l'inflammation par exemple, et finalement les modifications post-traductionnelles (MPT). Trois inhibiteurs ciblant l'activité chymotrypsin-like du protéasome ont été approuvés par la FDA depuis 2003 pour le traitement du myélome multiple. Cependant une meilleure compréhension de la régulation du protéasome permettrait des thérapies plus spécifiques ciblant des sous-types de protéasome et évitant d'éteindre inutilement des voies de régulations en aval pouvant causer des effets secondaires délétères. L'inhibition spécifique de l'immunoprotéasome a récemment montré une réduction du rejet de greffe et la suppression du cancer colorectal chez la souris.

Objectifs:
Ce projet a pour but de mieux comprendre le dialogue complexe entre les trois voies de régulation du protéasome. Pour cela, nous allons d'abord caractériser en profondeur son répertoire de protéoformes et de régulateurs/partenaires associés dans le contexte des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Puis nous étudierons les bases moléculaires expliquant l'interaction préférentielle entre les sous-types de 20S et leur différents régulateurs. Enfin nous criblerons des inhibiteurs ou activateurs spécifiques des sous-types de 20S associés à ces régulateurs.

Stratégies:
L'hétérogénéité des complexes du protéasome est un vrai défi et les approches classiques de protéomique ne sont pas capables de corréler cette diversité structurale avec ses diverses fonctions. Bien que très efficaces pour l'identification/quantification de protéines, elles ne prennent pas en compte les combinaisons de MPT qui peuvent générer différentes protéoformes. Pour pallier ce manque d'information nous analyserons ces protéines entières plutôt qu'après digestion enzymatique. Nous utiliserons des spectromètres de masse de dernière génération pour réaliser cette approche top-down et accéder aux différentes combinaisons de protéoformes présentes dans les extraits cellulaires et identifier les régulateurs spécifiques de certains sous-types de protéasome. Nous étudierons cette hétérogénéité dans le contexte des MICI puisque l'i20S est recruté au moins partiellement lors de l'inflammation. Nous utiliserons une autre approche innovante, l'échange hydrogène-deutérium couplé à la MS, pour comparer les conformations des protéasomes Std vs. i20S en l'absence ou présence des régulateurs PA28aß et PA28?. Cette méthode sera également utilisée pour identifier les interfaces d'interaction de partenaires nouvellement décrits et étudier l'interaction d'inhibiteurs spécifiques et non-spécifiques avec le Std vs. i20S . Finalement, nous effectuerons un criblage de ligands haut-débit en utilisant les chimiothèque, fragmentothèque et peptidothèque disponibles à l'institut (plateforme PICT).

Originalité:
Ces méthodes innovantes de MS structurale vont apporter un nouvel angle de vue sur notre compréhension de la régulation du protéasome, en étudiant comment sa diversité moléculaire et structurale peut expliquer ses différentes fonctions. De plus, notre stratégie de criblage de ligands ciblant des protéasomes associés à ses régulateurs est inédite et très prometteuse.