Décrypter les synthèses d'ARN par les pneumovirus – DecRisP

La famille des pneumovirus contient plusieurs virus infectant les voies respiratoires et induisant des pneumonies et bronchiolites sévères ou mortelles chez l'homme et les animaux. Citons en particulier le virus respiratoire syncytial (VRS) humain, le VRS bovin, le metapneumovirus humain, le metapneumovirus aviaire, et le pneumovirus porcin récemment découvert. Il n'y a pas de vaccins efficaces contre ces virus et les antiviraux se restreignent à la Ribavirine, un analogue de nucléoside toxique et non spécifique. Développer de nouvelles stratégies contre ces virus nécessite d’améliorer nos connaissances sur les mécanismes moléculaires de la réplication virale.

Ces virus possèdent un génome à ARN simple brin non segmenté de polarité négative de 15 kb environ et qui code pour une dizaine de gènes. Ce génome ARN est toujours enveloppé par la nucléoprotéine virale qui empêche toute détection de l’ARN par les senseurs de l’immunité innée et le protège contre des attaques cellulaires. Ce sont des virus enveloppés qui se répliquent dans le cytoplasme des cellules. Une fois les membranes virales et cellulaires fusionnées, le virus est libéré dans le cytoplasme sous forme d’une holo-nucléocapside associant la polymérase virale L, capable d’une part de synthétiser des ARNm viraux qui seront traduits par la machinerie cellulaire, et d’autre part de répliquer son génome pour créer de nouvelles particules virales qui bourgeonneront à la membrane plasmique grâce aux glycoprotéines néo-synthétisées. Nous voulons dans ce projet élucider les mécanismes de synthèse des ARNs viraux ainsi que les mécanismes d’encapsidation des génomes par les nucléoprotéines.

La machinerie virale synthétisant les ARN viraux est autonome et spécifique et formée par un complexe multi-protéique (pas d'équivalent cellulaire). Ce complexe est constituée de 3 protéines centrales: la polymérase L (250 kDa), la phosphoprotéine P, la nucléoprotéine N qui enserre l'ARN génomique. Les pneumovirus ont également des co-facteurs de transcription (M2-1) ou de réplication (M2-2). Pour synthétiser les ARNm ou répliquer le génome, la polymérase doit accéder temporairement à l’ARN viral en « ouvrant » la nucléocapside. En miroir, après synthèse des nouveaux génomes, ceux-ci vont être encapsidés par des protéines N néosynthétisées.

Dans ce projet, nous désirons élucider les mécanismes moléculaires et la régulation de ce processus complexe en associant 4 équipes aux compétences et expertises complémentaires :

(1) une équipe INRA possédant les outils moléculaires pour synthétiser et purifier les protéines N, P, M2-1 et L sous forme recombinante ainsi que des ARNs génomiques.
(2) une équipe IBS pouvant résoudre des structures par microscopie électronique et cryo-microscopie.
(3) une équipe IBMM (CNRS, Université Montpellier, ENSCM) spécialiste de la synthèse d’ARNs modifiés et variés au niveau de leur séquence (méthylation en différents sites des nucléosides) ou de l’extrémité 5’ par ajout de coiffes diverses.
(4) une équipe CNRS-U Aix-Marseille possédant les outils et le savoir-faire pour mesurer des activités enzymatiques portées par les protéines L.

Nos objectifs spécifiques principaux seront de:
- déterminer les mécanismes contrôlant la spécificité (séquence, nature chimique) d’encapsidation des ARN par les protéines N,
- caractériser la structure atomique des complexes protéine N-ARN,
- caractériser les modifications épitranscriptomiques des ARNs médiées par la protéine L (capping et méthylations).

A terme, nous souhaitons ainsi développer un système autonome de synthèse d'ARNs in vitro qui permettra d'étudier le fonctionnement de ce complexe et tester des composés antiviraux ciblant les étapes de réplication /transcription.