CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonction des macromolécules biologiques

IntpTN3, une recombinase unique, RecA-inépendante et dirigée par l'homologie: mécanisme, structure, partenaires et applications – IntpTN3

(1) La première approche concerne l'exploration du ou des composants protéiques de la réaction HR in vitro. Nous avons caractérisé plusieurs intégrases hyperthermophiles HR et non HR. Par échange de domaine et génération d'enzymes mutantes, nous visons à dissocier les deux activités de recombinaison et à découvrir les domaines impliqués dans HR. La résolution de la structure tridimensionnelle de IntpTN3, soit seul, soit avec des substrats d'ADN, contribuera à déterminer le mécanisme moléculaire précis de IntpTN3 HR. Comme les recombinases nécessitent souvent un facteur secondaire pour une activité complète, nous utiliserons des technologies de pointe pour détecter et identifier des partenaires protéiques supplémentaires impliqués dans IntpTN3 HR.
(2) Dans la seconde approche, nous explorerons la composante ADN de la réaction HR in vitro. Les mécanismes moléculaires observés in vivo impliquent l'appariement de régions chromosomiques avec une séquence d'ADN similaire ou identique et se produisent en l'absence de rupture de l'ADN. Un tableau de matrices d'ADN avec une homologie complète ou intercalée sera construit et dosé in vitro en présence d'IntpTN3. Il a été suggéré en outre que des structures particulières telles que l'ADN paranémique (PX-ADN) sont formées en appariement homologue, mais les preuves formelles font encore défaut. En conduisant à terme les réactions HR, IntpTN3 permettra d'étudier pour la première fois in vitro la topologie des substrats d'ADN impliqués dans ces mécanismes fondamentaux.
(3) Ces approches contribueront à mieux comprendre et également à améliorer la réaction IntpTN3 HR in vitro. Une preuve de concept démontrera et mesurera l'efficacité de cette réaction à l'aide de techniques de biologie moléculaire et de génétique bactérienne. Cette approche ouvrira la voie au développement de nouvelles technologies de manipulation chromosomique ou de thérapie génique.

Nous avons accompli des avancées substantielles sur la compréhension des mécanismes de recombinaison site-spécifique et de recombinaison homologue (RH) de l’intégrase IntpTN3 de T. nautili. Nous avons mis en évidence et publié un nouveau système d’évolution permettant à ces intégrases non seulement de se maintenir mais aussi d’évoluer et constituer de nouvelles spécificités de site (Badel et al, 2020). Nous avons fait le bilan et mis en évidence les caractéristiques particulières de toutes les recombinases à tyrosine archéennes dans un article de revue invitée publié récemment (Badel et al, 2021). Armés de toutes ces connaissances, nous avons développé la méthodologie de construction d’intégrases hybrides et rationalisé leur surproduction et purification. Nous nous sommes intéressés à identifier les domaines responsables de l’activité de recombinaison site spécifique des intégrases IntpTN3 et IntpTF1. Ces enzymes catalysent l’intégration des plasmides pTN3 et pTF1 respectivement dans le gène ARNtLeu de T. nautili et le gène ARNtSer de T. fumicolans. La construction de 9 intégrases hybrides présentant un échange progressif entre les domaines de ces deux enzymes a révélé que la spécificité dépend de la région C-terminale (résidus 150 à 450) alors que la région N-terminale (résidus 1 à 144) est équivalente. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux propriétés de RH de ces intégrases. Grâce à un nouveau service web d’analyse génomique que nous avons développé, BAGET (Hepp et al, 2021) nous avons identifié les trois intégrases supplémentaires étroitement apparentées à IntpTN3 et reconnaissant le même gène d’ARNtLeu. Après surproduction et purification, une seule de ces intégrases (IntIRI33C) possède, comme IntpTN3, la capacité de produire la RH. Le très faible nombre de substitutions et la construction de nouveaux hybrides entre des enzymes produisant cette RH ou non nous permettront d’identifier aisément les domaines responsables de cette activité.

Des résultats préliminaires spectaculaires ont été obtenus depuis le début de ce projet et nous prévoyons que d'autres données essentielles et des avancées importantes seront publiées dans des revues scientifiques à fort impact. Certains aspects originaux de cette recherche visent à générer des applications industrielles en thérapie génique seront protégés par un brevet par nos tutelles.

1: Hepp B, Da Cunha V, Lorieux F, Oberto J. BAGET 2.0: an updated web tool for the effortless retrieval of prokaryotic gene context and sequence. Bioinformatics. 2021 Feb 3:btab082. doi: 10.1093/bioinformatics/btab082. Epub ahead of print. PMID: 33532841.

2: Badel C, Da Cunha V, Oberto J. Archaeal tyrosine recombinases. FEMS Microbiol Rev. 2021 Feb 1:fuab004. doi: 10.1093/femsre/fuab004. Epub ahead of print. PMID:33524101.

3: Badel C, Da Cunha V, Forterre P, Oberto J. Pervasive Suicidal Integrases in Deep-Sea Archaea. Mol Biol Evol. 2020 Jun 1;37(6):1727-1743. doi:10.1093/molbev/msaa041. PMID: 32068866

Résumé de soumission

Nous avons publié récemment la découverte d'une nouvelle integrase (IntpTN3) codée par un plasmide provenant de l’archée anaérobie hyperthermophile Thermococcus nautili. En plus de ses propriétés canoniques d'intégration, d'excision et d'inversion spécifiques de site, cette recombinase à tyrosine présente des activités sans précédent. IntpTN3 est responsable de la génération d'un nombre d’inversions chromosomiques à grande échelle in vivo, chez son hôte naturel T. nautili. Nous avons reproduit avec succès ces inversions dans un système purifié in vitro exposant ainsi les propriétés très inhabituelles de recombinaison homologue (RH) de cette enzyme. IntpTN3 est capable de promouvoir des réactions de RH entre toute paire de segments d'ADN de séquence identique aussi courts que 100pb. La RH cellulaire est un mécanisme essentiel et complexe qui se produit dans chaque organisme; elle nécessite de l'énergie, un certain nombre de complexes de protéines et de processus coordonnés tels que la synthèse d'ADN. Contrairement à la RH cellulaire, la RH promues par IntpTN3 ne nécessite que l'enzyme et son substrat d'ADN: elle peut être obtenue efficacement dans le tube à essai. Le présent projet vise à décrypter les mécanismes moléculaires de la recombinaison par IntpTN3 afin d'améliorer nos connaissances fondamentales de la RH et d'utiliser ces connaissances pour développer de nouvelles applications biotechnologiques. Le projet suivra trois approches complémentaires:
(1) La première approche concerne l'exploration du ou des composants protéiques de la réaction HR in vitro. Nous avons caractérisé plusieurs intégrases hyperthermophiles RH et non-RH. En échangeant des domaines et en générant des enzymes mutantes, nous visons à dissocier les deux activités de recombinaison et à découvrir les domaines impliqués dans la RH. La résolution de la structure tridimensionnelle d’IntpTN3, seule ou avec des substrats d’ADN, sera déterminante pour la détermination du mécanisme moléculaire précis de la RH par IntpTN3. Comme les recombinases nécessitent souvent un facteur secondaire pour une activité complète, nous utiliserons des technologies de pointe pour détecter et identifier d'autres partenaires protéiques impliqués dans la RH par IntpTN3. (2) Dans la seconde approche, nous explorerons le composant ADN de la réaction RH in vitro. Dans un certain nombre de rapports, des mécanismes moléculaires observés in vivo impliquent l'appariement de régions chromosomiques avec une séquence d'ADN similaire ou identique et se produisent en absence de rupture de l'ADN. Il a été suggéré que des structures particulières telles que l'ADN paranémique (PX-ADN) se forment par appariement homologue, mais les preuves formelles font encore défaut. En conduisant les réactions HR à complétion, IntpTN3 permettra d’étudier in vitro pour la première fois la topologie des substrats d’ADN impliqués dans ces mécanismes fondamentaux. (3) Les approches précédentes contribueront à mieux comprendre mais également à améliorer la réaction RH in vitro catalysée par IntpTN3. Nous proposons une preuve de concept basée sur ces connaissances qui ouvre la voie au développement de nouvelles technologies pouvant être utilisées pour la manipulation de chromosomes ou la thérapie génique.
Des résultats préliminaires spectaculaires ont été obtenus depuis le début de ce projet et nous prévoyons d’autres données essentielles et des avancées importantes qui seront publiées dans des revues scientifiques à fort impact. Certains aspects originaux de cette recherche visent à générer des applications industrielles et seront protégés par brevet par nos tutelles.

Coordinateur du projet

Monsieur Jacques Oberto (Institut de Biologie Intégrative de la Cellule)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

MICALIS MICrobiologie de l'ALImentation au service de la Santé
LM2E LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE DES ENVIRONNEMENTS EXTRÊMES
Pasteur INSTITUT PASTEUR
I2BC Institut de Biologie Intégrative de la Cellule

Aide de l'ANR 454 811 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2019 - 48 Mois

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