CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonction des macromolécules biologiques

Imagerie sensible à la phase de nombreux marqueurs réversiblement photocommutables en lumière modulée – HIGHLIGHT

Résumé de soumission

La fluorescence est devenue une observable essentielle en biologie et en médecine. La distinction d’un marqueur fluorescent repose généralement sur l’optimisation de sa brillance et de ses propriétés spectrales. En dépit de sa popularité, cette approche souffre cependant de certaines limitations. L'extraction d'un signal fluorescent est difficile dans les échantillons autofluorescents et/ou diffusant la lumière. La déconvolution spectrale des bandes d’absorption et d’émission se chevauchant ne permet de distinguer que quelques marqueurs, ce qui limite fortement l’expression du potentiel de stratégies émergentes de génie génétique, de techniques de bioimagerie avancée et de tests diagnostiques hautement multiplexés pour lesquels distinguer des dizaines de marqueurs serait nécessaire.
Notre consortium de chimistes, physiciens et biologistes propose d’introduire HIGHLIGHT (PHase-sensItive imaGing of reversibly pHotoswitchable Labels after modulatIon of activatinG ligHT) exploitant uniquement une ou deux longueur(s) d'onde en excitation et en émission pour une imagerie de fluorescence hautement multiplexée et sans aberration chromatique. HIGHLIGHT vise à étendre les dimensions de discrimination des fluorophores, bien au-delà des informations spectrales et de concentration, telles que mises en œuvre dans la stratégie Brainbow ou d'autres approches de marquage multicolore de cellules. Avec HIGHLIGHT, la discrimination ne nécessite plus de signatures spectroscopiques singulières, d’instruments sophistiqués, ou de traitement complexe des données pour l’extraction des signaux. En revanche, elle implique la conception de schémas réactifs et d’observables à même de promouvoir et récupérer sélectivement la réponse d’un marqueur cible.
HIGHLIGHT exploite ainsi des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables (RSFP) comme marqueurs. Exploitées pour les microscopies super-résolues et pour le contraste dynamique, elles ne sont pas seulement fluorescentes, mais sont aussi engagées dans de riches photocycles. Les protocoles HIGHLIGHT en exploitent les réponses spécifiques de la fluorescence à la modulation d’illumination dans des conditions bien conçues fournissant plusieurs dimensions de contraste dynamique pour surmonter les limitations rencontrées avec la discrimination spectrale. Seules ou combinées après apprentissage statistique, elles fourniront des observables pour imager en temps réel plus de dix marqueurs fluorescents spectralement similaires et discriminer plus de cent teintes créées en mélangeant ces marqueurs en quantités variables et en les ciblant dans différents territoires cellulaires. Comme preuve de principe, nous proposons de mettre au défi HIGHLIGHT dans deux contextes où la pénurie de marqueurs fluorescents spectralement distincts représente un obstacle majeur: l’analyse de la lignée des sous-types de cellules rétiniennes et celle de leur connectivité dans la rétine aviaire.
Dans ce projet, nous allons pour cela (i) concevoir et mettre en œuvre une série d’outils transgéniques permettant d’exprimer des combinaisons variées de 6 à 12 RSFPs dans une population de cellules; (ii) concevoir des protocoles HIGHLIGHT pour les microscopies à champ large et à balayage, ainsi que les stratégies de codage à barres correspondantes pour distinguer différentes cellules; (iii) évaluer les propriétés de photocommutation des RSFPs sous excitation à un et deux photons dans différents environnements; (iv) valider la mise en œuvre d’HIGHLIGHT au moyen d’un microscope confocal commercial et de microscopes à feuillet de lumière à la pointe de la technologie permettant de repousser les limites de profondeur et de vitesse d'acquisition; (v) effectuer une analyse clonale multiplexée dans la rétine des vertébrés, ainsi que le traçage d'un neurone et l'analyse de la convergence axonale. Les outils et les protocoles développés au cours ce projet trouveront une applicabilité quasi universelle pour les observations multiplexées en biologie.

Coordination du projet

Thomas LE SAUX (Processus d'Activation Sélectif par Transfert d'Energie Uni-électronique ou Radiatif)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IdV Institut de la vision
LPTMC Laboratoire de physique théorique de la matière condensée
PASTEUR Processus d'Activation Sélectif par Transfert d'Energie Uni-électronique ou Radiatif
LOB Laboratoire d'optique et biosciences

Aide de l'ANR 485 750 euros
Début et durée du projet scientifique : mars 2020 - 42 Mois

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