Coupure des cous membranaires par les ESCRT-III – Neck4Fission

La machinerie ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) catalyse un large éventail de processus physiologiques et pathologiques de remodelage membranaire, y compris le bourgeonnement de vésicules et de virus enveloppés, la division cellulaire et de nombreux autres processus impliquant des bourgeonnements topologiquement similaires. La machinerie eucaryote est composée de 5 sous-complexes, ESCRT-0, ESCRT-I, ESCRT-II, ESCRT-III et d'une ATPase VPS4. ESCRT-III et VPS4 constituent la partie de la machinerie qui exécute la fission membranaire. Les études existantes suggèrent que certains membres du complexe ESCRT-III, CHMP4, CHMP3 et CHMP2, jouent un rôle essentiel dans la constriction et la fission des membranes et pourraient représenter avec VPS4 une machinerie de fission minimale. Étant donné que les ESCRT opèrent à l'intérieur de cous membranaires, comprendre comment les filaments d'ESCRT s'organisent en association avec VPS4 pour obtenir une constriction et un clivage de la membrane reste un défi majeur. L'objectif de notre projet est de comprendre les bases structurelles et les mécanismes des processus de remodelage membranaire catalysés par le complexe ESCRT-III et VPS4, conduisant à la fission des membranes.
Les ESCRTs fonctionnent dans des systèmes membranaires variés tels que le "midbody" cytokinétique où le diamètre de la structure membranaire doit diminuer à partir du micromètre jusqu'à la constriction complète et la fission alors que le bourgeonnement de virus enveloppés ou de vésicules nécessite un rétrécissement du cou de la membrane seulement à partir de diamètres inférieurs à 50 nm. Dans ce projet, nous nous focaliserons sur la reconstitution de la constriction et de la fission membranaire à partir de faibles diamètres, correspondant aux vésicules ou aux virus enveloppés. Notre hypothèse est que le recrutement et la polymérisation de la machinerie ESCRT-III sur des membranes nécessitent des géométries optimales telles qu'une caténoïde complète (en forme d'haltère), ou tronquée telle que le col d’un tube connecté à une membrane.
L'objectif de NECK4FISSION est de mettre au point des systèmes modèles de cols membranaires ayant des géométries mimant celles des structures membranaires natives pour permettre la reconstitution de la fission membranaire avec une machinerie minimale d'ESCRT et VPS4. Nous développerons quatre systèmes in vitro différents pour reconstituer la fonction d'ESCRT-III/VPS4. Deux sont basés sur des tubes membranaires préformés autour de polymères d'ESCRT-III ou formés à partir de GUVs et deux autres sont basés sur la reconstitution de systèmes de bourgeonnement artificiels de type virus dans des GUVs et des LUVs. Nous utiliserons des techniques d'imagerie à haute résolution et de micromanipulation pour établir les conditions nécessaires à la fission ; nous élaborerons des techniques d'imagerie avancée de cryo-EM pour visualiser l'effet des ESCRT-III et de VPS4 sur les tubes membranaires et sur le bourgeonnement de particules ressemblant à des virus à partir de LUVs et de GUVs. Ces expériences in vitro seront complétées par de l'imagerie en Cryo-TM du site de bourgeonnement du VIH-1 en utilisant le FIB-SEM. Enfin, toutes ces données seront prises en compte pour mettre au point un nouveau modèle physique de fission membranaire basé sur le couplage élastique entre la machine ESCRT et la topologie locale de la membrane et sur les contraintes visqueuses membranaires créées par le remodelage de l'ESCRT-III dépendant de l'ATP, ce qui n'a pas encore été envisagé. Ainsi, nous pourrons comprendre comment les ESCRT-III et VPS4 contribuent à la déformation de la membrane et aux stresses mécaniques sous différentes contraintes géométriques.
Globalement, nos résultats permettront d'obtenir de nouvelles informations importantes sur la fonction, la structure et la dynamique de la fission membranaire catalysée par ESCRT-III/VPS4 et sur les mécanismes sous-jacents.