Assemblage dynamique de foldamères oligoamides aromatiques pour la stabilisation d'interactions protéine-protéine – FOLDynamic

La méthode de « tethering« ou ancrage covalent utilisée dans ce projet repose sur le criblage d'une bibliothèque de foldamères contenant des fonctions disulfures dans des conditions partiellement réductrices pour favoriser un échange rapide de thiols et permettre la sélection du complexe d'affinité la plus élevée qui peut ensuite être identifié par spectrométrie de masse. Des études simultanées par cristallographie et RMN fourniront des données au niveau atomique sur l'adduit covalent protéine-foldamère pour faciliter l'optimisation des interactions foldamère-protéine, permettant finalement d'éliminer l'ancrage covalent.
La méthodologie envisagée repose sur des améliorations itératives des ligands via des boucles de rétroaction : une fois qu'un premier hétérodimère de protéines via des foldamères organisés en double hélice hybrides est obtenu et caractérisé par des méthodes biophysiques (RMN en solution, cristallographie des rayons X), l'optimisation des séquences de foldamères pour obtenir un complexe quaternaire stable non covalent sera réalisée grâce à la modélisation moléculaire par remplacement de chaîne latérale in silico et minimisation d'énergie. L'affinité et les données cinétiques des complexes seront déterminées par titrage RMN et études en résonance plasmonique de surface.

La réalisation de cette première partie du projet FOLDynamic a permis :
-la synthèse maitrisée de foldamères hybrides QnQXm sur support solide (SPS), avec de bons rendements et une grande pureté. (Q: monomère delta-aminoacide 2,8-quinoline fonctionnalisé en position 4 avec une chaine latérale protéinogène, QX: monomère aminoacide 2,7-quinoline substitué en position 8 par un groupement de type Chloro, Fluoro, methoxy, ethoxy.. et fonctionnalisé en position 4 avec une chaine latérale protéinogène)
-la validation de l’accrochage de ligands sur une chaine latérale d’un monomère directement en SPS une fois la séquence de l’oligomère complétée.
-la détermination du nombre (n et m) et de la nature idéale (QX) des monomères pour des séquences de foldamères permettant une hybridation complète en doubles hélices en milieu aqueux.
-la production de mutants cystéines des protéines CypA et CnB ciblées pour cette étude.

Pour la suite du projet, nous allons étudier les conditions d'ancrage des foldamères aux protéines d’intérêt, vérifier l’hétérodimérisation des adduits protéine/foldamère via la formation de doubles hélices de foldamères et étudier les interactions mises en jeu par RMN, MS et RX. Suivant la boucle itérative décrite dans notre approche, nous optimiserons ensuite les interactions par des études de modélisations sur de nouvelles séquences de foldamères permettant l'élimination du point d'ancrage covalent, et l'étude des complexes quaternaires (2protéines + 2 foldamères) supramoléculaires ainsi formés.

pas encore de publication de résultats

Les interactions protéine-protéine (IPPs) jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques et pathologiques et représentent des cibles potentielles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. La plupart des IPPs visées nécessitent le développement d’inhibiteurs pour empêcher l’association des deux partenaires protéiques. L’approche inverse, restant encore largement inexplorée pour les cibles thérapeutiques, consiste à moduler des IPPs par l’intermédiaire de stabilisateurs qui renforcent ces interactions. C’est le cas notamment de la cyclosporin A (CsA) qui stabilise la formation du complexe immunosuppresseur CyclophilineA/Calcineurin (CypA/Cn). Or cette petite molécule, couramment utilisée dans le traitement contre le rejet de greffes, présente des effets secondaires non négligeables de part surtout son absence de spécificité pour la protéine Cn. La recherche de nouvelles stratégies de stabilisation du complexe CypA/Cn est donc souhaitable.
Les foldamères synthétiques ont connu un développement rapide au cours de la dernière décennie, motivé par l’espoir de pouvoir remplir des fonctions identiques, voire supérieures à celles des biopolymères. Parmi ceux-ci, les foldamères d’amides aromatiques se distinguent par leurs conformations en solution exceptionnellement prévisibles, ajustables et stables, une synthèse relativement facile d’objets secondaires et tertiaires de taille similaire à celle de petites protéines, ainsi qu’une grande aptitude à la croissance cristalline et à l’élucidation structurale. Ces caractéristiques désignent ces foldamères d’amides aromatiques comme des échafaudages potentiels pour porter des chaînes latérales protéinogènes et ainsi construire des ligands pour de grandes surfaces protéiques. Les foldamères de 8-fluoro/chloro quinoline développés dans notre équipe ont la propriété de former des doubles hélices hybridées, ce que nous proposons d’exploiter pour construire des complexes supramoléculaires stabilisant des hétérodimères de protéines, et notamment CypA/Cn dans le cadre de ce projet.
Comment cependant disposer rationnellement des chaines latérales sur un foldamère pour lier une protéine cible en l’absence de données structurales des complexes ? Des résultats préliminaires démontrent la possibilité d’obtenir la structure détaillée d’une interface foldamère-protéine même en l’absence d’une association forte si les deux molécules sont attachées par une sorte de lien. L’approche que nous proposons s’inscrit dans le domaine de la chimie combinatoire dynamique, en screenant une bibliothèque de foldamères équipés de terminaisons disulfures sur les protéines CypA et CnB (sous-unité B de Cn) pour lesquelles un thiol sera introduit en surface par mutation (Xaa?Cys). L’analyse par SM permettra de révéler les complexes de meilleure affinité et donc de sélectionner les séquences de foldamères correspondantes. Une analyse structurale poussée sera ensuite réalisée avec ces séquences, par cristallographie et par RMN en solution, à l’aide de protéines marquées. Les données obtenues seront ensuite utilisées pour optimiser les interactions protéine-foldamère, notamment grâce à des outils de modélisation. L’amélioration itérative des interactions devrait permettre la conception de foldamères hybridés en double hélice, capable de relier les protéines CypA et Cn en un complexe supramoléculaire, même en l’absence des liens covalents.
Ces résultats poseront les bases pour de futurs foldamères ciblant l’immunosuppression via les IPPs présentées. Cependant, de nombreuses étapes qui sortent du champ de la recherche proposée devront être franchies avant de poursuivre un objectif thérapeutique (toxicité, métabolisme, biodisponibilité, immunogénicité). Nous prévoyons néanmoins un impact significatif dans le domaine spécifique de la reconnaissance biomoléculaire par les foldamères, ou dans le domaine plus général de la compréhension de la communication entre molécules synthétiques et biologiques.