Fonctionnalisations sélectives des tyrosines de protéines par électrochimie-click – E-CLICK

De nouveaux dérivés de phénylurazole et de luminol ont été synthétisés pour étudier leurs comportements électrochimiques afin d’identifier les cibles électro-actives les plus prometteuses pour la réaction tandem électro-oxydation/tyrosine-click.

Nos résultats montrent que les ancres N-méthylées du phénylurazole et du luminol sont plus réactives, au point de doubler la modification du phénol lorsqu’un excès de réactif est présent.
Trois peptides ont été choisis pour étudier et comparer les sélectivités et cinétiques des dérivés azido-armés vis-à-vis de la modification de protéines. Des cibles plus complexes, telles que l’albumine bovine, les enzymes mannosidase et glucose oxydase, et l’anticorps thérapeutique Trastuzumab, ont été efficacement conjuguées par voie électrochimique et par une sonde fluorescéine grâce à la stratégie en deux temps 1) électro-bio-conjugaison avec le dérivé azoture du luminol, 2) et la e-click réaction avec la cyclooctyne-fluorescéine.

Nous avons conçu une méthode douce pour le marquage des tyrosines des protéines qui montre une sélectivité vis-à-vis du noyau phénol de ces cibles. Cette méthode simple permet la modification rapide de nombreuses protéines bio-conjuguées ce qui pourrait avoir un impact fort dans le domaine thérapeutique. Nous sommes actuellement en train d’investiguer ces différentes possibilités. La méthodologie optimisée d’électro-bio-conjugaison des tyrosines est en train d’être appliquée à des systèmes plus complexes d’intérêt biologique/médical, avec de nouveaux dérivés fonctionnels du luminol.

Luminol anchors improve the electrochemicaltyrosine-
click labelling of proteins†
S´ebastien Depienne, Dimitri Alvarez-Dorta, Mikael Croyal,
Ranil C. T. Temgoua, Cathy Charlier,e David Deniaud, Mathieu M´evel, Mohammed Boujtita and Sébastien G. Gouin
Chemical Science, 2021, 12, 15374 – 15381 - DOI: 10.1039/d1sc04809k
Chemical Science
Received 31st August 2021
Accepted 3rd November 2021

Les réactions de bio-conjugaisons orthogonales sont très utilisées pour la modification sélective de protéines, aussi bien dans les domaines thérapeutiques que pour des applications industrielles en biotechnologies. Les applications courantes incluent i) le couplage de toxines, ou de radiopharmaceutiques sur des anticorps dans les thérapies anticancéreuses, ii) le couplages de sondes fluorescentes en protéomique, iii) le design de glyco-vaccins ou des oligosaccharides microbiens sont greffés sur des protéines porteuses, iv) la PEG-ylation de proteines pour en améliorer leurs propriétés biophysiques et pharmacodynamiques. Ces modifications structurales sont généralement effectuées sur les groupement amines des lysines qui sont abondantes, en utilisant des esters activés (N-hydroxysuccinimides) pour le couplage, des chlorures de sulfonyles, ou des fonctions isothiocyanates. De façon alternative, les résidus cystéines, qui sont plus rares, peuvent être modifiés par des échanges de ponts disulfures et des additions de type Michael. En comparaison les 18 autres acides aminés ont été beaucoup moins exploités dans les réactions de bio-conjugaison.
Une des alternatives récentes les plus prometteuses consiste en la modification sélective des tyrosines (Y) en utilisant une réaction chimique de type click. Il a été montré que des urazoles oxydés comme la 4-phenyl-3H-1,2,4-triazole-3,5(4H)-dione (PTAD) sont capables de réagir sur les groupements phénols des Y par une réaction d'ène addition. Cette nouvelle méthode de Y-click s'est montrée relativement chimiosélective et a permis de greffer plusieurs types de conjugués sur les Y de peptides et de protéines. La Y-click possède cependant de nombreuses limitations qui ne permettent pas une application large spectre dans le domaine des bioconjugaisons. En effet, celle si nécessite l'utilisation d'un excès d’oxydant chimique pour générer l'espèce réactive PTAD, d'autre part, des tampons spéciaux doivent être utilisés pour piéger un isocyanate résultant de la décomposition rapide du PTAD, et qui s'additionne de façon parasite sur les résidus lysines.
Le projet e-click propose de résoudre ces différents problèmes et de considérablement étendre l'applicabilité des réactions de bioconjugaisons. Nous utiliserons de façon originale l'électrochimie pour activer l'ancre PTAD de façon contrôlée et in situ, et dans différents tampons de protéines. Cet objectif sera réalisé en appliquant un potentiel électrochimique contrôlé et qui ne perturbe pas la structure des amino-acides et des protéines. Nos résultats préliminaires sont particulièrement prometteurs avec une preuve de concept établie sur des peptides et protéines biologiquement actifs. Les réactions de couplage s’effectuent avec de haut rendements, sans présence de produits parasites, et en conservant l'intégrité structurale des peptides et protéines. D'autre part la possibilité d'activer l'espèce réactive in situ et à la demande, ouvre la possibilité nouvelle et inexplorée de cibler des Y spécifiques de la protéine proches d'un site actif. Cet objectif ambitieux devrait être atteint par ss-e-click ou un ligand de la protéine comportant un espaceur de taille approprié et relié à l'ancre urazole sera d'abord co-incubé avec la protéine avant l'application du potentiel électrochimique. Le ligand orientera ainsi la position et la sélectivité du couplage. La ss-e-click représenterait une nouvelle voie de synthèse d'inhibiteurs suicides permettant des couplage sélectifs, la détection de protéines à activités spécifiques, ou l'identification de sites de reconnaissance.
Le projet e-click sera conduit par une équipe d'experts chimistes, électrochimistes, spectroscopistes et biologistes, à forte complémentarité et bien identifiés dans leurs domaines de recherche respectifs. En proposant l'électrochimie comme voie douce et sélective d'activation, il devrait avoir un impact majeur dans le domaine des bio-conjugaisons.