CE20 - Biologie des animaux, des organismes photosynthétiques et des microorganismes

Elucider les bases cellulaires de la fécondité chez le poisson : dynamique et régulation de l’ovogenèse chez le medaka – DynaMO

Élucider les bases cellulaires de la fécondité chez le poisson

Dynamique de l’ovogenèse dans l’ovaire chez le médaka et sa régulation par les miARN

Associer l’analyse descriptive, l’analyse fonctionnelle et la modélisation pour comprendre la régulation de l’ovogenèse et de la fécondité chez le médaka.

La maîtrise de la quantité d’œufs produits à chaque cycle de reproduction (fécondité) est un enjeu important que ce soit pour la gestion des populations sauvages de poissons ou en tant que levier d’amélioration de la compétitivité des élevages aquacoles. La dynamique globale de l’ovogenèse (taux et fréquence de recrutement, puis de croissance des ovocytes au sein de l’ovaire) peut être extrêmement variable que ce soit entre les différentes espèces de poissons, qui présentent des fécondités très variables, mais également au sein d’une même espèce en fonction des conditions environnementales. Les mécanismes qui gouvernent la dynamique de recrutement/croissance des ovocytes durant l’ovogenèse restent toutefois peu connus, essentiellement en raison des difficultés méthodologiques inhérente à l’histologie classique en 2D (sur coupes) qui ne permet pas d’accéder à la totalité des ovocytes. Chez le médaka, un petit poisson d’aquarium à cycle de reproduction court utilisé pour étudier l’ovogenèse, nous avons mis en évidence une vingtaine de miARNs exprimés de façon prédominante dans l’ovaire, dont un miARN (miR-202) jouant un rôle crucial pour le succès reproducteur femelle et notamment la fécondité. Outre ces données sur le rôle clé de miR-202, les données préliminaires dont nous disposons sur les autres miARNs suggèrent qu’ils pourraient également jouer un rôle important dans la régulation de la fécondité chez le médaka. L’objectif du projet DynaMO est de comprendre précisément non seulement la dynamique globale de l’ovogenèse mais aussi le rôle de ces miARNs dans ce processus. Notre ambition est ici d’aller au-delà d’une simple liste de miRNAs régulateurs de l’ovogenèse en apportant des connaissances précises sur la dynamique de l’ovogenèse chez les poissons intégrant sa régulation par les miARNs. Dans ce but, nous associerons des approches descriptive, fonctionnelle et de modélisation, faisant appel à l’imagerie 3D, l’édition de génome et les mathématiques.

Dans la première étape du projet, purement descriptive, nous analyserons de façon exhaustive le contenu en ovocytes (en nombre et en taille) présents dans l’ovaire au cours des cycles de reproduction à l’échelle de l’organe entier. Cette étape utilisera les dernières avancées en imagerie tridimensionnelle (3D) et en bio-informatique de l’image. Les données obtenues seront ensuite utilisées pour construire un modèle de la dynamique d’ovogenèse grâce à des approches de modélisation mathématique et de simulation numérique. Dans une deuxième partie du projet, plus fonctionnelle, certains miARNs seront invalidés grâce à la technologie CRISPR/Cas9 et les mutants présentant une fécondité réduite seront soumis à double phénotypage : histologique (par imagerie 3D) et moléculaire (analyse transcriptomique par RNA-seq). Le modèle de l’ovogenèse préalablement obtenu sera exploité pour chaque mutant afin de décrire les altérations de la dynamique de l’ovogenèse chez ces mutants. Ces modèles seront également analysés à la lumière des données transcriptomiques obtenues afin de mieux comprendre la régulation de la dynamique de l’ovogenèse par les miARNs.

Le projet DynaMO, débuté il y a 18 mois, a déjà permis d’analyser par imagerie tri-dimentionnelle (3D) le contenu en ovocytes des ovaires de médaka au cours des cycles de reproduction et de débuter la construction d’un modèle mathématique de la dynamique de l’ovogenèse. Un protocole pour l’étude en 3D des ovaires de poisson a ainsi été mis en place et publié1. Cette méthode (nommée C-ECi) rassemble toutes des étapes nécessaires à la préparation des échantillons, à l’imagerie 3D et à l’analyse bio-informatique des images obtenues. La méthode C-ECi est la première méthode publiée permettant l’analyse en 3D des ovaires chez le poisson et permettra d’apporter des données quantitatives pour étudier le processus d’ovogenèse chez le médaka. Dans le cadre du projet DynaMO, nous avons également sélectionné un miARN particulier sur la base de ses caractéristiques d’expression. La génération d’un mutant pour ce miARN nous permettra d’étudier son rôle potentiel de régulateur de l’ovogenèse et de la fécondité chez le médaka.

1- Lesage M, Thomas M, Bugeon J, Branthonne A, Gay S, Cardona E, Bobe J, Thermes V. C-Eci: A Cubic-Eci Combined Clearing Method For 3D Follicular Content Analysis In The Fish Ovary. Developmental Biology; 2020. doi: doi.org/10.1101/2020.03.05.978189

Au cours de la deuxième période du projet DynaMO, les mesures de contenus ovocytaires au cours des cycles de reproductions seront complétées et le modèle mathématique de la dynamique de l’ovogenèse affiné. Ce modèle sera également complété par les données obtenues à partir de plusieurs mutants de fécondités dont le mutant pour le miARN-202 déjà connu (lesage et.al., 2018) mais aussi un mutant qui sera généré pour le nouveau miARN candidat identifié dans la première partie du projet.

Lesage M, Thomas M, Bugeon J, Branthonne A, Gay S, Cardona E, Bobe J, Thermes V. C-Eci: A Cubic-Eci Combined Clearing Method For 3D Follicular Content Analysis In The Fish Ovary. Developmental Biology; 2020. doi: doi.org/10.1101/2020.03.05.978189

La maîtrise de la quantité d’œufs produits à chaque cycle reproducteur (fécondité) est un enjeu important que ce soit pour la gestion des populations sauvages de poissons ou en tant que levier d’amélioration de la compétitivité des élevages aquacoles. La dynamique globale de l’ovogenèse (taux et fréquence de recrutement, puis de croissance des ovocytes au sein de l’ovaire) peut être extrêmement variable que ce soit entre les différentes espèces de poissons, qui présentent des fécondités très variables, mais également au sein d’une même espèce en fonction des conditions environnementales. Les mécanismes qui gouvernent la dynamique de recrutement/croissance des ovocytes durant l’ovogenèse restent toutefois à ce jour peu connus, essentiellement en raison de difficultés méthodologiques inhérente à l’histologie classique (2D sur coupes) qui ne permet pas d’accéder facilement à la totalité des ovocytes à l’échelle de l’ovaire entier. Chez le médaka, un petit poisson d’aquarium à cycle de reproduction court utilisé pour étudier l’ovogenèse, nous avons récemment mis en évidence une vingtaine de miARNs exprimés de façon prédominante dans l’ovaire, dont un miARN (miR-202) jouant un rôle crucial pour le succès reproducteur femelle et notamment la fécondité. Les miARNs sont des régulateurs fins de l’expression des gènes qui sont impliqués dans le contrôle de nombreux processus biologiques et les données préliminaires dont nous disposons indiquent qu’il jouent un rôle important dans la régulation de la fécondité chez le médaka. L’objectif du projet DynaMo est de comprendre précisément non seulement la dynamique globale de l’ovogenèse mais aussi le rôle des miARNs dans ce processus. Notre ambition est ici d’aller au delà d’une simple liste de miRNAs régulateurs de l’ovogenèse en fournissant une vision précise de ce processus intégrant la dynamique cellulaire et ses régulations par les miRNAs. Dans ce but, nous associerons une approche descriptive (par imagerie 3D), une approche fonctionnelle (grâce aux techniques d’édition du génome) et une approche de modélisation mathématique. Dans la première tâche du projet, une analyse exhaustive du nombre et de la taille des différents ovocytes présents dans l’ovaire sera réalisée par imagerie 3D à l’échelle de l’organe entier après une étape transparisation. Réalisée de façon concomitante, la deuxième tâche du projet consistera à invalider par une approche d’édition de génome via la technologie CRISPR/Cas9 des miARNs spécifiques sélectionnés à partir du pool de miARNs récemment identifiés. Les mutant présentant une fécondité réduite seront soumis à la fois à un phénotype histologique complet par imagerie 3D (tâche 3) et un phénotypage moléculaire approfondi par RNA-seq associé à la prédiction des cibles potentiels de miARNs (tâche 4). Enfin, la tâche 5 visera à modéliser la dynamique d’ovogenèse à partir des données obtenues dans la tâche 1 pour les animaux contrôles (sauvage). Ce modèle sera exploité pour chaque mutant à partir des données issues de la tâche 3 afin de mieux comprendre les altérations de la dynamique de l’ovogenèse associées à chaque mutant étudié. Enfin, les dynamiques associées à chaque mutant seront analysées à la lumière des données transcriptomiques obtenues dans la tâche 4 afin de mieux comprendre la régulation de la dynamique de l’ovogenèse par les miARNs.

Coordinateur du projet

Madame Violette Thermes (Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

LPGP Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons

Aide de l'ANR 312 876 euros
Début et durée du projet scientifique : janvier 2019 - 48 Mois

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