Analyse à haut-débit du réassortiment entre virus influenza A par microfluidique et séquençage du génome ARN de virus uniques - application à l’analyse du risque pandémique et à l’optimisation des virus candidats vaccins – microFLU-REASSORT

Méthodes de virologie et de biologie cellulaire comprenant la production de stock viraux et le marquage et le tri de cellules. Méthodes de biologie moléculaire pour la production de transcrits viraux, la synthèse de billes portant des amorces barcodées, et la génération de banques pour le séquençage Illumina. Méthodes de microfluidique en gouttes à haut débit.

Le principal résultat du projet microFlu-REASSORT à ce jour est i) la mise en place d’un « pipeline » expérimental et bioinformatique pour générer et traiter les données issues du séquençage en cellules uniques ; et ii) la démonstration de la faisabilité de la détection des huit segments du génome grippal associés au sein de chaque goutte, de manière spécifique et avec une quasi-absence de confusion entre segments issus des deux souches virales. Une expérience de réassortiment entre deux virus influenza saisonniers humains H1N1 et H3N2 sera bientôt lancée et parachèvera la preuve de concept.

Le pipeline expérimental et bioinformatique sera utilisé pour quantifier expérimentalement et de manière statistiquement robuste le résultat de réassortiments génétiques impliquant des IAVs porcins et/ou aviaires jugés préoccupants du point de vue du risque pandémique, afin d’ajouter un élément prédictif aux outils d'évaluation des risques pandémiques utilisés par l'OMS et le CDC et d’optimiser des Virus Vaccinaux Candidats (CVV).

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Les virus influenza A (IAV) sont des agents pathogènes majeurs responsables d’épidémies hivernales, et de pandémies occasionnelles causées par l’émergence de virus antigéniquement nouveaux, issus du réassortiment génétique entre IAVs humains et animaux. En effet, lorsqu’une cellule est co-infectée par deux ou plusieurs IAVs, les 8 ARN génomiques de chacun des virus parentaux peuvent se réassortir, donnant lieu à une progénie virale aux phénotypes nouveaux et imprévisibles. Le nombre théorique de génotypes issus du réassortiment entre deux virus est de 256 (2e8) mais cette diversité n'a jamais été observée in vitro ni in vivo et certains gènes co-ségrègent, suggérant que le réassortiment est biaisé. Les techniques de virologie actuelles ne permettent pas d’étudier le réassortiment de manière exhaustive ni quantitative et il est donc impossible d’évaluer la probabilité d’émergence de nouveaux IAV réassortants.
L'objectif de µFlu-REASSORT est d’implémenter une approche novatrice de microfluidique en goutte afin de quantifier expérimentalement et de manière statistiquement robuste le résultat du réassortiment génétique entre deux souches d'IAV, afin d’ajouter un élément prédictif aux outils d'évaluation des risques pandémiques utilisés par l'OMS et le CDC.

Les deux premiers objectifs de notre projet sont (i) de développer et (ii) de valider un système de séquençage à haut débit, en goutte, de virus unique (le système µFlu) pour analyser un grand nombre de réassortants, en niveau de confinement 2 ou 3. Nous adapterons un système microfluidique en goutte de séquençage ARN en cellule unique et à haut débit (scRNA-seq) afin de réaliser, à l’aide de code-barres, un séquençage de nouvelle génération parallélisé de > 10e5 génotypes viraux individuels issus d’une co-infection avec deux IAV.
Le troisième objectif est d'utiliser le système µFlu pour évaluer la probabilité d’émergence de virus potentiellement zoonotiques et/ou pandémiques après réassortiment entre un virus humain et des virus H9N2 ou H6N6 d’origine aviaire qui circulent dans les élevages porcins en Asie, et qui, dans le cas du virus H9N2, ont été à l’origine de cas sporadiques d’infection chez l’homme. Le potentiel de réassortiment de ces virus avec un virus humain, pouvant déboucher sur l'acquisition d'une capacité de réplication et/ou d’une transmissibilité accrues chez l’homme, soulève de nombreuses inquiétudes. Une évaluation systématique de leur potentiel de réassortiment contribuera à la sélection de virus vaccinaux candidats (CVV) appropriés.
Enfin le système µFlu sera utilisé pour améliorer les rendements et la teneur en antigènes de CVVs produits par génétique inverse contre un virus HxNy d'intérêt, en étudiant le réassortiment entre la souche vaccinale PR8 et le virus HxNy et en identifiant une combinaison de segments optimale : un isolat précoce de la pandémie de 2009 sera utilisé comme modèle de virus HxNy.

Le succès du projet µFlu-REASSORT repose sur les compétences complémentaires de deux équipes : (i) N. Naffakh (coordinateur, Institut Pasteur, Paris), ayant une forte expertise en biologie des IAV, virologie moléculaire et ingénierie des virus, et des liens solides dans les domaines de la surveillance humaine et animale et (ii) A. Griffiths (ESPCI Paris), ayant une grande expérience de phénotypage en cellule unique et de tri par microfluidique en goutte, désormais combinés avec du scRNA-seq. L'apport, non financé par l’ANR, de l'expertise de H. Isambert (Institut Curie, Paris) permettra d’intégrer les données de surveillance et celles générées par µFlu à de nouveaux algorithmes d'apprentissage automatisé pour prédire le réassortiment génétique.
Le système µFlu ouvrira la voie à l’étude du réassortiment d'autres virus segmentés et à la constitution d’un réseau de recherche compétitif et unique centré autour de la microfluidique à haut débit pour du scRNA-seq de pathogènes nécessitant un niveau de confinement 2 ou 3.