Sphingolipides hépatiques dans la NAFLD: de la biosynthèse hépatique aux conséquences métaboliques – SONIC

Les études seront réalisées sur des hépatocytes en culture primaire de rongeurs, sur des animaux génétiquement modifés et sur des plasmas, biopsies hépatiques de patients avec DT2 ou maladie métabolique du foie (MASLD).

Nous avons étendu notre précédente étude et réalisé une analyse lipidomique sur les plasmas de deux cohortes indépendantes de patients DT2 (CERADIAB n=90 ; DIACART n=149) afin d’analyser les espèces sphingolipidiques présentes dans le plasma et chercher les facteurs qui pouvaient expliquer l’augmentation des DhCer circulants chez les patients DT2. Dans ces deux cohortes, nous retrouvons une augmentation spécifique des Dhcer comparés aux céramides. Parmi tous les paramètres biologiques analysés, nous avons pu mettre en évidence au sein de ces 2 cohortes une corrélation positive entre les DhCer circulants et des biomarqueurs des stéatopathies hépatiques (NAFLD) : le stéatotest et le FLI (Fatty Liver index) qui évaluent la stéatose, le NASHtest qui évalue la stéatohépatite et l’Actitest qui évalue l’activité inflammatoire. Les céramides n’étaient associés à aucun de ces biomarqueurs des NAFLD. Nous avons également montré que plus les concentrations de DhCer circulants étaient élevées, plus les marqueurs de stéatose (FLI ou steatotest) ou de stéatohépatite (NASHtest) augmentaient. Ces résultats nous ont conduits à l’hypothèse que les DhCer circulants avaient une origine hépatique et que leur augmentation dans la circulation chez les DT2 étaient probablement dus à la présence d’une NAFLD.

L’observation que les concentrations de DhCer circulantes sont corrélées avec la sévérité de l’atteinte hépatique nous a conduit à rechercher sous quelle forme les DhCer circulaient dans le plasma. Pour cela, nous avons recruté une troisième cohorte de patients DT2 et isolé les différentes lipoprotéines. Nous avons réalisé une analyse lipidomique des espèces sphingolipidiques présentes dans ces fractions. Nous avons montré que les DhCer étaient principalement retrouvés dans les VLDL et ces VLDL étaient d’autant plus enrichies en DhCer qu’il y avait une stéatose hépatique ou une NASH prononcée. Cet enrichissement dans les VLDL ne se retrouvait pas pour les céramides, et ne se retrouvait pas non plus avec les autres lipoprotéines. Donc, en cas de stéatose hépatique ou de NASH, les patients sécrètent des VLDL enrichies en DhCer. Nous avons émis l’hypothèse que les patients avec stéatose ou NASH présentaient probablement une synthèse hépatique de novo des sphingolipides accrue. Nous avons donc analysé l’expression d’enzymes clés de la biosynthèse des sphingolipides dans des biopsies hépatiques de 73 patients avec ou sans DT2. Nous montrons que l’expression de plusieurs enzymes de la voie comme la SPTLC1, DEGS1 et SGMS1 est augmenté chez les patients présentant une stéatose ou une NASH et que leur expression est augmentée avec le stade de stéatose ou de NASH.

Nos données permettent de comprendre l’effet prédicteur des DhCer sur la survenue du DT2 puisque les patients avec stéatose présentent un risque accru de DT2 et la surproduction de VLDL est une des caractéristiques de la dyslipidémie que présentent les patients DT2 ou avec syndrome métabolique.`

Les études réalisées chez l’homme nous ont conduit à l’hypothèse que les DhCer synthétisés en excès par le foie au cours de la stéatose ou de la NASH et retrouvées majoritairement dans les VLDL pourraient jouer un rôle dans la biosynthèse de ces dernières. En effet, plus la stéatose ou la NASH augmentent, plus les concentrations de DhCer dans les VLDL sont importantes. Pour appuyer cette hypothèse, il faut rappeler que la biosynthèse des sphingolipides de même que celle des VLDL ont lieu au niveau du réticulum endoplasmique (RE), les VLDL naissant par bourgeonnement à partir des membranes du RE. Le processus de biosynthèse des VLDL nécessite d’une part la lipidation de l’apolipoprotéine B par la microsomal transfert protéine (MTP) pour donner naissance à une préVLDL puis la fusion de cette préVLDL avec des gouttelettes lipidiques enrichies en triglycérides pour former des VLDL natives.

Afin d’étudier le rôle des DHCer dans le foie, nous avons manipulé les concentrations de DhCer dans les hépatocytes en culture primaire en les traitant d’une part avec des DhCer exogènes (fluorescents ou non) et d’autre part en inhibant la DhCer désaturase (DES), enzyme responsable de la désaturation des DhCer en céramides. L’utilisation de DhCer couplé à un fluorochrome (le NBD) nous a permis de montrer que les DhCer exogènes se localisent principalement au niveau des membranes du RE de l’hépatocyte. Au contraire, dans des conditions stéatosiques (en présence d’oléate et de palmitate), les DhCer se relocalisent au niveau des gouttelettes lipidiques (Figure ci-dessous). Nous avons été surpris de voir que les Dhcer étaient retrouvés au sein des gouttelettes lipidique et pas au niveau de la membrane de la gouttelette ce qui étonnant pour un lipide. De plus, les hépatocytes traités avec du dhcer présentent des gouttelettes lipidiques de plus grosse taille suggérant que les Dhcer pourraient favoriser la fusion des gouttelettes lipidiques. Nous avons ensuite isolé les gouttelettes lipidiques des hépatocytes et réalisé une analyse lipidomique du contenu. Nous montrons que les Dhcer exogènes se retrouve dans la gouttelette principalementsous la forme d’acylDhcer (une forme neutre qui explique sa localisation intragouttelette.) Finalement, nous avons étudié si les dhcer des gouttelettes pouvaient se retrouver dans les VLDL sécrétés par les cellules. Pour cela nous avons incubé des cellules hépatocytaires humaines HepG2 aveC du dhcer deutéré Et nous avons isolé Les VLDL produits dans le milieu de culture. Une analyse en spectro de masse a permis de montrer que ces VLDl étaient enrichis en Dhcerdeutéré.