Remodelage du microbiote de moustique pour étudier son impact sur la transmission du paludisme – MosMi

Analyse de microbiote:
Le moustiques ont été collectés grâce à des pièges de types Mosquito magnet et BG sentinel. Leurs intestins ont été disséqués dans des conditions aussi propres que possibles afin de limiter les contaminations environnementales. Leur ADN a été extrait, la région V3-V4 du gène codant l'ARNr 16S bactérien a été amplifié et séquencé par Illumina Miseq. La composition du microbiote a été analysé en utilisant les outils Qiime et R et les entérotypes ont été définis en utilisant les outils développés par Arumugam et collaborateurs.
Isolements bactériens:
Les moustiques collectés ont été disséqués et leurs intestins ont été broyés dans du milieu de culture liquide. Le broyat a été transféré dans du milieu liquide ou solide de types TSB, BHI, LB, LB/lait, gélose au sang, bouillon marin. Ces cultures ont été conservées à 30°C dans des conditions aérobies ou anaérobies.
Production de moustiques axéniques
Les œufs de moustiques ont été stérilisés à l'eau de javel et à l'éthanol, afin d'obtenir des larves axéniques. Pour permettre leur développement, ces larves ont été colonisées par des bactéries auxotrophes, qui requièrent deux acides aminés bactéries-spécifiques, l'acide mésodiaminopimélique [mDAP] et la d-Alanine [D-Ala], pour leur multiplication. Ces acides ont été apportés aux larves pendant leur développement afin de soutenir la colonisation bactérienne, elle-même requise pour le développement larvaire.

Analyse du microbiote
Nos resultats avec Anopheles darlingi (vecteur du paludisme), indique une nette discrimination entre deux cluster de composition de microbiote, qui correspondent presque parfaitement aux deux localités de collecte. La date dans la saison, le status de gorgement au sang et l'état des ovaires (femelle gravide ou non) n'a aucun impact sur ces enterotypes, ce qui suggère une stabilité au sein d'une population. Les deux entérotypes identifiés sont dominés l'un par les genre Pseudomonas, l'autre par Escherichia-Shigella. Chez le vecteur de la dengue Aedes aegypti, nos données indiquent l'existence de deux clusters moins nettement séparés l'un de l'autre. Ils sont respectivement dominés par les genres Halomonas et Pseudomonas. Nous n'avons pas trouvé de corrélations entre ces entérotypes et nos métadonnées de collecte.

Etablissement d'une banque d'isolats bactériens
Notre banque contient actuellement 330 souches bactériennes dont la taxonomie a été identifiée: elles appartiennent à (3 genres, 32 familles et 6 classes (dont plus de 50% de Gammaproteobactéries, mais aussi des Actinobactéries, Betaprotéobactéries, Alphaprotéobactéries, Flavobactéries et Bacilli).

Productoin de moustiques axéniques
Nous avons trouvé que tant que mDAP et D-Ala sont fournis dans le régime alimentaire larvaire, les bactéries sont capables de coloniser leur hôte, mais à la fin du développement, alors que les pupes ne se nourrissent plus et que le régime adulte ne contient pas ces acides aminés spécifiques, les bactéries auxotrophes sont éliminées. Nous avons aussi établi que ces moustiques ont un développement suivant une dynamique identique à celle de moustiques contrôles. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que nous avons produit des moustiques intéressants à recoloniser par des cohortes mimant les entérotypes identifiés. Nous avons utilisé ce système pour analyser pourquoi les bactéries sont si importantes au développement larvaire par approche transcriptomique.

Le principal résultat pour l'instant est la production de moustiques axéniques par colonisation transitoire, qui sera un outil important en biologie des vecteurs et pour les investigations insecte/microbiote. De plus, nos données sur le rôle des bactéries dans le développement larvaire apportent une connaissance plus approfondie de ces interactions moustique/microbiote, en indiquant que les bactéries jouent un rôle métabolique important pour le développement larvaire en fournissant des viatmines, notamment le folate et en promouvant le stockage d'énergie.

Publications:
Romoli, O. & Gendrin, M. Springer Protocols Handbooks. Springer 179–189 (2020) doi:10.1007/978-1-0716-0259-1_11.

Chabanol, E., Behrends, V., Prevost, G., Christophides, G.K., & Gendrin, M. Antibiotic treatment in Anopheles coluzzii affects carbon and nitrogen metabolism. Pathogens (2020) doi:10.3390/pathogens9090679.

Preprint en revision pour Nature Communications:
Romoli, O., Schönbeck, J. C., Hapfelmeier, S. & Gendrin, M. Bacteria contribute to mosquito development via folate biosynthesis and energy storage. go.nature.com/3b4TeC4.

Les vecteurs du paludisme ne peuvent transmettre la maladie que s'ils sont d'abord infectés par un humain. Le microbiote de moustique protège son hôte contre l'infection parasitaire et affecte négativement sa fitness, et donc les risques de transmission. Les études fonctionnelles du microbiote ont jusqu'ici porté sur des moustiques de laboratoire, dont le microbiote est différent de celui de terrain. La recherche de terrain, elle, est descriptive ou permet d'identifier des corrélations. Dans ce projet, nous développerons un modèle pour étudier l'effet de la composition du microbiote sur la transmission du paludisme en Guyane. Nous étudierons d'abord la composition du microbiote des vecteurs de paludisme amazoniens sur le terrain et reproduirons des types de microbiote (entérotypes) simplifiés dans des moustiques de laboratoire. En utilisant ces modèles, nous éluciderons si certains entérotypes affectent la transmission via la permissivité du moustique à l'infection et sa fitness.