Structure et fonctions de la protéine C du virus Nipah – NiPah-C

Le projet utlise un combinaisons d'approches complémentaires en protéomique, biochimie des protéines, biophysique, biologie structurale et virologie moléculaire et cellulaire en utilisant des installations de pointe sur le site de chaque partenaire pour:
(1) Cartographier l'interactome NiV C par TAP-MS.
(2) Reconstituer et caractériser des complexes avec des protéines de l'hôte
(3) Comprendre l'interdépendance dans l'expression des protéines superposées et l'expression d'une protéine C' tronquée.
(4) Comprendre comment les protéines virales créées de novo par surimpression ont des propriétés de séquence inhabituelles et sont souvent impliquées dans la pathogénicité virale.

(1) La structure cristalline du domaine C-terminal de la protéine C d'un virus homologue a été résolue et affinée.
(2) Des virus Nipah recombinants n'exprimant pas la protéine C ou exprimant la protéine C à partir d'une cassette indépendante du gène P ont été générés

- Caractérisation structurale de la protéine TPMV C en longueur par SAXS.

- Comparaison des infections de cultures cellulaires par le NiV w.t., NiV?C et le NiV TMPV-C pour identifier les rôles de la protéine C et déterminer si le TPMV C peut jouer les mêmes rôles dans le contexte d'un NiV manquant d'expression de C.

- Cartographie de l'interactome par tap-tag/spectrométrie de masse en utilisant le TPMV C complet comme appât et comparaison avec l'interactome du NiV C.

- Le partenaire 3 validera les données de l'interactome en répétant la sélection par tap-tag en utilisant un autre ensemble de tags et, avec le partenaire 1, caractérisera l'interactome du NiV C dans les cellules infectées par le NiV.

- Le clonage du NiV C complet dans d'autres vecteurs a commencé en vue d'une future expression dans des cellules d'insectes et de mammifères.

- Reconstitution de complexes par mélange de la fraction C-terminale du NiV C avec les partenaires purifiés et caractérisation biophysique

- Optimisation des conditions pour les expériences d'expression du minigénome

- Sur la base de nos connaissances actuelles et de l'analyse de la structure des protéines du virus C de Tupaia, des mutations des protéines NiV C ont été conçues pour perturber les interactions avec différents partenaires et ces mutations seront testées avec le système du minigénome

- Les caractéristiques de croissance des virus n'exprimant pas C ou C' ou exprimant C ou C' à partir de la cassette indépendante devraient être étudiées dès que le laboratoire BSL4 sera ouvert pour fonctionner

STRUCTURAL DESCRIPTION OF THE NIPAH VIRUS PHOSPHOPROTEIN AND ITS INTERACTION WITH STAT1. Jensen MR, Yabukarski F, Communie G, Condamine E, Mas C, Volchkova V, Tarbouriech N, Bourhis J-M, Volchkov V, Blackledge M & Jamin M. doi.org/10.1016/j.bpj.2020.04.010

L'objectif du projet Nipah-C est de déchiffrer les rôles de la protéine non structurale C (NiV C) dans la réplication et la pathogénicité du virus Nipah en caractérisant structurellement et fonctionnellement les interactions avec différents facteurs viraux et de l'hôte, en perturbant spécifiquement certaines de ces interactions et en évaluant les effets sur la réplication virale et la pathogénicité et en étudiant comment une protéine peut être créée de novo par surimpression sur un gène existant.

NiV est un virus à ARN négatif non segmenté de la famille des Paramyxoviridae, qui exprime trois protéines non structurales (V, W et C) à partir des gènes P et C chevauchants. Ces protéines sont des facteurs de virulence impliqués dans l'antagonisme des défenses de l'hôte et dans le détournement des machineries cellulaires. Le partenaire 2 a démontré qu'un virus recombinant déficient en expression de la protéine C peut se répliquer dans la cellule mais est atténué in vivo, et récemment, de nouvelles connaissances ont été obtenues sur certaines fonctions biologiques du NiV C, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents et leur importance pour la virulence et la pathogénicité demeurent largement inconnus. Nous sommes aujourd'hui dans une situation optimale pour aborder les problèmes. Les obstacles à surmonter sont (1) l'identification des facteurs viraux et de l'hôtes qui interagissent directement avec NiV C, (2) la reconstitution de complexes protéiques impliquant NiV C et un partenaire et la détermination de leur structure et (3) la possibilité de supprimer ou de muter la protéine NiV C sans perturber l'expression ou l'intégrité des protéines apparentées P, V et W qui sont exprimées à partir du gène chevauchant.

Pour atteindre ces objectifs, les partenaires apporteront des expertises complémentaires et utiliseront des techniques de pointe en protéomique, biophysique moléculaire, biologie structurale et virologie moléculaire et cellulaire notamment au laboratoire BSL-4 Mérieux à Lyon. Plus précisément, nous allons (1) cartographier l'interactome de NiV C, (2) reconstituer plusieurs complexes protéiques à partir de composants purifiés et caractériser leurs propriétés et leur structure, (3) générer des virus Nipah recombinants qui n'expriment pas de protéine C ou expriment C à partir d'une cassette de transcription indépendante, évaluer leur aptitude à la réplication virale et par mutagenèse évaluer le rôle des différentes interactions protéine-protéine, et (4) sélectionner des protéines artificielles qui se lient spécifiquement à NiV C pour perturber la fonction de NiV C dans le contexte de cellules infectées par le type sauvage NiV exprimant ses protéines non structurales à partir de gènes P et C naturels. Sur la base de nos travaux antérieurs et de différents résultats préliminaires, notamment (1) une cartographie initiale de l'interactome de NiV C, (2) la découverte en utilisant de nouveaux anticorps anti-C qu'une forme tronquée de C est également exprimée dans des cellules infectées par NiV, (3) la disponibilité de nouvelles constructions de gènes P à partir desquelles aucune forme aberrante de C ou de P ne peut être produite et (4) la production et la purification de différentes formes de NiV C ainsi que la reconstitution de deux complexes protéiques, nous sommes très optimistes quant à la réussite du projet.

Le virus Nipah (NiV) est l'un des virus zoonotiques les plus pathogènes et les plus meurtriers infectant les humains et à risque de pandémie. Le NiV provoque une encéphalite sévère et une maladie respiratoire avec des taux de létalité pouvant dépasser 70%, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents de son pouvoir pathogène sont inconnus. Aucun vaccin ou traitement spécifique n'est actuellement approuvé pour la thérapie humaine alors que la transmission de personne à personne observée dans les récentes flambée de NiV soulève le spectre d'une nouvelle menace pour la santé humaine et l'économie.