Etude de la dynamique structurale des protéines dans les cellules par spectroscopie RPE – into_the_cell

L’étude structurale des biomolécules in vitro ne peut pas capturer toutes la complexité de l'environnement cellulaire et une information limitée et quelque fois erronée est donc obtenue. Dans la cellule, les protéines fonctionnent et interagissent dans un environnement complexes, dynamiques et sont soumises à un encombrement moléculaire extrême (cellular crowding).
Comme l'environnement cellulaire est difficilement reproductible in vitro, l’étude des biomolecules directement à l'intérieur des cellules a connu un intérêt croissant au cours de la dernière décennie. Le développement de méthodologies couplant une grande sensibilité, aucune limitation de taille de la biomolecule étudiée et la capacité de suivre les transitions structurelles et les interactions protéine-protéine directement dans les cellules représente un objectif major et un challenge pour le futur en biologie structurale. Parmi les techniques basées sur les résonances magnétiques, le marquage de spin (en anglais, Site-Directed Spin Labeling -SDSL) couplé à la spectroscopie de Résonance Paramagnétique Électronique (RPE) est une technique attrayante et compétitive, mais actuellement caractérisée par une série de restrictions qui limitent ses applications cellulaires.
L’objectif ambitieux de ce projet est de développer une approche novatrice basée sur le développement de nouveaux outils et méthodes pour la technique SDSL-RPE dans le but d’élucider la dynamique structurale des protéines, les interactions protéine-protéine et les changements structuraux au niveau moléculaire, directement dans les cellules.
La technique du SDSL-RPE est une approche robuste qui connait un très fort développement au cours de la dernière décennie et s’avère très puissante pour l’étude des systèmes biologiques complexes et pour le suivi des interactions protéine-protéine. Cette technique est basée sur l’insertion spécifique en un site d’intérêt de la protéine d’une sonde paramagnétique exogène (en général radical nitroxyde stable), et sur l’analyse de ses propriétés par spectroscopie RPE. Cependant, bien que plusieurs études aient démontré la faisabilité de l’approche « in-cell EPR », cette technique est actuellement fortement limitée par i) la pénurie de nitroxides stables dans le contexte cellulaire ; ii) le manque de méthodes efficaces pour le transport intracellulaire des protéines et iii) le manque de méthodes permettant le suivi et la caractérisation structurale de complexes protéine-protéine dans l’environnement cellulaire.
Avec l’objectif de mener le SDSL-RPE au-delà de ses limites actuelles et vers la possibilité de réaliser des études de protéines au niveau moléculaire directement à l'intérieur des cellules, nous proposons : i) la conception et la synthèse de nouveaux nitroxides (ex situ labeling) et d’acide aminé non-naturel portant un nitroxide (in cell labeling), stables dans l'environnement cellulaire et ayant des caractéristiques RPE améliorées pour l'étude des protéines directement à l'intérieur des cellules; ii) le développement de méthodes efficaces pour le transport des protéines marquées à l’intérieur des cellules bactériennes; iii) le développement de méthodes robuste et précise pour explorer la dynamique des protéines et leurs interactions par « in-cell RPE ».
Dans le cadre du projet proposé, le développement de nouvelles sondes de spin et de stratégies pour délivrer les protéines marquées dans les cellules ouvrira la possibilité de réaliser l’étude de biomolecules dans leur environnement physiologique par RPE haute résolution et permettra d’aborder la question de comment le milieu intracellulaire façonne la dynamique structurale des protéines et leurs interactions. Les nouveaux outils développés seront utilisés pour étudier deux protéines chaperone bactériennes, NarJ et UreG dans des cellules de E. coli et B. pasteurii, respectivement.