CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonctions des macromolécules biologiques

Etudes des mécanismes contrôlant l'assemblage de structures fonctionnelles des héparanes sulfates pendant la biosynthèse – GAGOsynth

Décrypter les mécanismes par lesquels les motifs fonctionnels des héparanes sulfates sont assemblés au cours de la biosynthèse

Les héparanes sulfates (HS) sont des polysaccharides complexes de la surface cellulaire. Grâce à leur capacité à lier des centaines de protéines, ils régulent de très nombreux processus biologiques. Ce vaste répertoire fonctionnel est lié à leur diversité structurale, enzymatiquement générée en cours de biosynthèse. Ce processus étant non codé génétiquement, le mécanisme déterminant la structure des HS reste mal connu.

Production et caracterisation des enzymes de biosynthèse des HS

Dans ce contexte, le but de déchiffrer comment les enzymes biosynthétiques des HS s'associent les unes aux autres pour former des «nanomachines« déterminant l'assemblage de motifs HS spécifiques. Dans ce but, nous exprimerons les enzymes de biosynthèse des HS, analyserons leurs interactions, la structure des complexes qu'ils forment et les séquences oligosaccharidiques qu'ils produisent. L'activité de liaison des oligosaccharides résultants vis-à-vis de cytokines se liant aux HS sera analysée pour révéler les relations structure/fonction de ces molécules. Les connaissances acquises permettront de synthétiser de nouveaux oligosaccharides de structures définies en utilisant des approches chimio-enzymatiques.

Obtention d’enzymes sous forme native en utilisant divers systèmes d’expression (cellule d’insecte, cellules mammifère).

Analyse des interactions par différentes approches biophysiques (ITC, BLI, MST, SPR, AUC ou spectrométrie de masse native) après obtention des partenaires purifiés.

Ingénierie oligosaccharidique pour l’obtention de substrats, spécifiques de chaque enzyme, en utilisant la souche E Coli K5 dont la capsule polysaccharidique est identique au squelette carboné des HS (GlcA-GlcNAc).

Analyse structurale des enzymes, seules ou en complexes par cristallographie aux rayons X ou Cryo-microscopie électronique.

L'un des défis majeurs de la caractérisation des polysaccharides synthases EXT1 et EXT2 est leur expression et leur purification. Ces enzymes réalisent la réaction d'élongation de la chaîne HS en polymérisant les résidus GlcNAc et GlcA. Les premiers tests d'expression ont montré que la co-expression des deux protéines augmente le rendement et la stabilité. La NDST, qui existe sous quatre isoformes (NDST1-4), est une enzyme bi-fonctionnelle qui catalyse la N-dé-acétylation et la N-ré-sulfation des résidus GlcNAc. Nous avons pu exprimer et purifier en quantité suffisantes pour des analyses enzymatiques les isoformes 1 et 2 et, grâce à l’obtention de substrats spécifiques (GlcA-GlcN ou GlcA-GlcNAc), nous déterminons leurs paramètres cinétiques pour leurs deux activités, soit globalement, soit individuellement. Les enzymes de biosynthèse Glce et 2OST ont été exprimées en système HEK293, et dans le but de favoriser la purification d’un complexe Glce-2OST, plusieurs plasmides ont été générés pour la co-expression des domaines catalytiques des deux enzymes dans les systèmes d’insecte baculovirus et mammifère (en cours d’optimisation). Nous avons également cloné la 6OST humaine mais l’enzyme n’est pas secrétée dans le milieu de culture mais résidente dans les cellules. En parallèle, nous avons généré des plasmides permettant l’expression des deux enzymes sous forme entière à la surface de vésicules extracellulaires mais l’analyse biophysique et structurale des vésicules purifiées n’a pas révélé la présence des enzymes à leur surface.

Pour la prochaine période, nous allons poursuivre l’optimisation de la production des enzymes, focaliser nos efforts pour l’analyse de leurs interactions et débuter leur analyse structurale, seule ou en complexe. Finalement nous caractériserons la structure oligosaccharidique des produits qu’elles catalysent.

Annaval T., Wild R., Crétinon Y., Sadir R., VivèsR.R. and Lortat-Jacob H. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules 25, 4215 (2020)

Les héparanes sulfates (HS) sont des polysaccharides complexes de la surface cellulaire. Grâce à leur capacité à lier des centaines de protéines, ils régulent de très nombreux processus biologiques. Ce vaste répertoire fonctionnel est lié à leur diversité structurale, enzymatiquement générée en cours de biosynthèse. Ce processus étant non codé génétiquement, le mécanisme déterminant la structure des HS reste mal connu. Dans ce contexte, nous avons réuni un consortium complémentaire dans le but de déchiffrer comment les enzymes biosynthétiques des HS s'associent les unes aux autres pour former des "nanomachines" déterminant l'assemblage de motifs HS spécifiques. Dans ce but, nous exprimerons les enzymes de biosynthèse des HS, analyserons leurs interactions, la structure des complexes qu'ils forment et les séquences oligosaccharidiques qu'ils produisent. L'activité de liaison des oligosaccharides résultants vis-à-vis de cytokines se liant aux HS sera analysée pour révéler les relations structure/fonction de ces molécules. Les connaissances acquises permettront de synthétiser de nouveaux oligosaccharides de structures définies en utilisant des approches chimio-enzymatiques.

Coordination du projet

Hugues Lortat-Jacob (INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IBS INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE
AFMB Architecture et fonction des macromolécules biologiques

Aide de l'ANR 490 997 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2018 - 48 Mois

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