Nanoémetteurs de carbure de silicium et exaltation optique pour l'analyse de transport intracellulaire dans les réseaux 3D de neurones – SINAPSE

Il y a principalement trois axes de développement physique dans le projet SINAPSE. Le premier est le développement d’un microscope pour un scan 3D rapide et en régime de super-localisation, à l’aide d’un dispositif d’holographie numérique : une matrice de micro-miroirs joue le rôle de modulateur spatial de lumière et permet de positionner un spot laser en différents points de l'espace de l'échantillon. Le microscope sera capable de localiser la particule avec une précision de quelques dizaine de nanomètres à une cadence supérieure au kHz. Un autre axe est dédié à la fabrication et la caractérisation de nanocristaux pouvant être utilisés comme sonde dans les cellules. Les SiC sont étudiés. Une irradiation permet d'inclure des défauts cristallins pour l'émission de fluorescence dans l'IR. D'autre particules sont explorées, comme les BaTiO3, dans lesquelles il est possible d'inclure des terres rares pour l'émission de fluorecence. Les deux types de particules ont des propriétés non linéaires efficaces pour l'émission de second harmonique, ce qui en fait de bonnes candidates pour les applications de microscopie à deux photons en profondeur. Le dernier axe de travail concerne la modélisation, fabrication et caractérisation de nanosondes hybrides métallo-diélectrique pour l’exaltation des signaux optiques afin de gagner en rapport signal sur bruit et/ou diminuer la puissance d’excitation pour éviter des dommages photo-induits.

Le système optique est monté et en cours de validation pour le suivi en translation des NPs. Une partie du projet est aussi de mesurer l’orientation des NPs en utilisant l’anisotropie d’émission de second harmonique : elle sera implémentée dans les mois à venir.

Les travaux sur les NPs de SiC se sont heurtés au fait que les NP sont fortement agrégées. Plusieurs essais ont été menés pour les désagréger, mais nous n’avons pas encore trouvé de solution fiable. Du point de vue expérimental, nous avons pour l’instant recentré l’étude sur la génération de second harmonique (GSH) afin de continuer les travaux sur la fabrication de nano-sondes hybrides et d’avancer sur le dispositif de microscopie. Nous utilisons pour cela des NP de KTiOPO4 (KTP) ou bien de BaTiO3 (BTO). Les nanoBTO ont par ailleurs été dopés avec des terres rares (Erbium/Ytterbium) qui émettent dans le proche IR, et représentent une alternative aux SiC pour l’objectif de bi-modalité d’émission. Toutefois, l’émission infrarouge (à 1.5 µm pour le dopage à l’Er) reste trop faible.

Le dispositif de caractérisation de GSH des NP au SPEC a permis d’estimer les coefficients non-linéaires de NPs individuelles de KTP, BTO et BTO dopé. Le dopage du BTO réduit l’efficacité de GSH (réduction d’un facteur 2 de l’intensité SHG pour un dopage Er de 0.5%).

Le processus de fabrication des systèmes hybrides cœur-coquille (NP de BTO au cœur et coquille d’or) ont été validés par le LPEM. Des échantillons BTO-Au et KTP-Au devraient être analysés prochainement. Des mesures préliminaires ont permis de vérifier que la coquille d’or n’était pas source d’un signal de SHG additionnel.

Les simulations numériques sur le système cœur-coquille ont été menées à bien, ce qui permet de viser les bonnes géométries pour les meilleurs résultats en termes de brillance d’une part et de limitation de l’élévation de la température d’autre part.

Une campagne va reprendre sur le SiC dans l’année à venir en utilisant cette fois un substrat « wafer » de SiC de poly-type 4H irradié par des protons (pour créer des défauts lacunaires) puis broyé en nanoparticules, à la différence des précédentes expériences menées sur des nanoparticules de polytype cubique.

Les nanoparticules hybrides vont être fabriquées et mesurées.

Nous commençons à préparer le dispositif de microscopie à recevoir des échantillons biologiques (achat d'une enceinte thermalisée et d'atmosphère en CO2 contrôlée en particulier). Le microscope sera testé d'abord sur du transport de nanoparticules dans des puits microfluidiques, puis validé dans des cultures 2D de neurones, avant d'observer des tranches de cerveau de souris ou d'organoïdes cérébraux fabriqués à partir de cellules humaines pluripotentes.

- Intraneuronal transport abnormalities revealed by optically active photostable nanoparticle tracking, IBS conference on advanced optical imaging, Seoul, Corée du Sud, oral invite (F. Marquier, LuMIn, juin 2019)
- Towards 3D single-particle tracking for intraneuronal transport characterization, Live cell single molecule tracking symposium, Ulm, Allemagne, poster (F. Semmer LuMIn, novembre 2019)
- Suivi de nanoparticules en mouvement dans des réseaux de neurones, workshop académique-industriel les nanos pour le vivant, LPS, Orsay, poster (F. Marquier LuMIn, avril 2019)
- Nanoparticle orientation tracking in neuronal networks using second harmonic signal detection, Journée du Labex Nanosaclay, C2N, Orsay, poster (F. Semmer LuMIn, septembre 2019)
- Second-harmonic generation (SHG) of single dielectric nanoparticles for bio-imaging, 25ième Congrès général de la SFP, Nantes, présentation orale (W. DJAMPA TAPI, CEA SPEC Juil (2019))
- Probing intraneuronal transport in vivo with optically active photostable nanocrystals, séminair e invité au LAMBE, EVRY (F. Treussart et F. Marquier, LuMIn, janvier 2020)

SINAPSE est un projet interdisciplinaire aux interfaces de la physique, de la chimie et de la neurobiologie. L'objectif principal du projet est le développement d'une nouvelle classe de nanoparticules (NP) avec des réponses optiques linéaire et non linéaire efficaces dans le domaine spectral du proche infrarouge (NIR), pour des applications de bio-imagerie. Plus spécifiquement, ces nano-marqueurs seront optimisés pour permettre la mesure des paramètres de transport intracellulaire dans les axones et les dendrites au sein d’un réseau neuronal 3D. La quantification précise du transport intraneuronal peut en effet révéler l'impact fonctionnel de facteurs de risque génétiques de maladie neuropsychiatrique ou neurodégénérative, comme nous l'avons déjà démontré dans des cultures 2D. Dans ce but, les NPs optiquement actives sont spontanément internalisées par les neurones dans des vésicules endosomales, qui sont ensuite transportées par des moteurs moléculaires le long du cytosquelette. Le mouvement de translation et de rotation des NPs sera déduit de deux signaux optiques complémentaires provenant de la même particule individuelle : la fluorescence dans la fenêtre NIR et la génération second harmonique (SHG), tous deux excités par le même laser de pompe infrarouge. La gamme spectrale NIR (excitation et fluorescence) est parfaitement adaptée à la fenêtre de transparence des systèmes biologiques, ce qui est d'une importance cruciale pour l'imagerie en profondeur dans les tissus cérébraux.

Nous proposons d'étudier pour la première fois la réponse optique bimodale qui provient de l'excitation NIR de nanocristaux de carbure de silicium (nanoSiC). Par rapport à l'état actuel des traceurs optiques utilisés en biologie, le nanoSiC présente l'avantage de permettre l'émission dans deux modes : la SHG générée par la matrice hôte et la fluorescence NIR provenant de défauts de ponctuels dans le cristal, générés par irradiation avec un faisceau de protons suivi d’un recuit thermique. Une autre tâche clé du projet SINAPSE sera d'améliorer ces deux signaux en tirant parti de nanoantennes métalliques (plasmoniques) associées au nanoSiC, afin d'obtenir le meilleur rapport signal/bruit. Les deux processus complémentaires d'émission de lumière au niveau de la particule unique seront finalement utilisés pour analyser les caractéristiques fines de la dynamique du mouvement vésiculaire dans des neurones de réseaux 3D, à haute résolution spatio-temporelle et à une profondeur allant jusqu’à 100 µm.

SINAPSE regroupe 4 partenaires complémentaires (Laboratoire Aimé Cotton, CEA-SPEC, Laboratoire Charles Fabry, Laboratoire de Physique et d'études des matériaux) qui ont obtenu des résultats préliminaires prometteurs. En pratique, le projet se déroulera selon trois tâches principales correspondant aux trois axes logiques du projet :
- Production et caractérisation des nanoparticules optiquement actives bimodales.
- Amélioration de leurs propriétés optiques grâce à l'utilisation de nanoantennes plasmoniques.
- Mesure de la dynamique de translation et d'orientation des nanoparticules dans les neurones.
Notre consortium réunit une gamme unique d'expertise en nanochimie, en optique non linéaire, en science des nanomatériaux, en bio-imagerie avec des nanoparticules et en génétique moléculaire appliquée aux maladies neuropsychiatriques/dégénératives, nécessaires pour atteindre les objectifs ambitieux du projet. Le projet vise aussi le défi d'une meilleure compréhension des mécanismes neuropsychiatriques/maladies dégénératives. Il pourrait donc avoir un impact significatif sur la santé, à long terme, compte tenu de la forte prévalence de ces maladies dans le monde et de la connaissance limitée des processus clés qui conduisent à l'apparition des premiers symptômes. Il est essentiel de comprendre ces processus pour mettre au point des traitements capables d'arrêter le développement de la maladie au stade pré-symptomatique.