Nanoémetteurs de carbure de silicium et exaltation optique pour l'analyse de transport intracellulaire dans les réseaux 3D de neurones – SINAPSE

Il y a principalement trois axes de développement physique dans le projet SINAPSE. Le premier est le développement d’un microscope pour un scan 3D rapide et en régime de super-localisation, à l’aide d’un dispositif d’holographie numérique : une matrice de micro-miroirs joue le rôle de modulateur spatial de lumière et permet de positionner un spot laser en différents points de l'espace de l'échantillon. Le microscope sera capable de localiser la particule avec une précision de quelques dizaine de nanomètres à une cadence supérieure au kHz. Un autre axe est dédié à la fabrication et la caractérisation de nanocristaux pouvant être utilisés comme sonde dans les cellules. Les SiC sont étudiés. Une irradiation permet d'inclure des défauts cristallins pour l'émission de fluorescence dans l'IR. D'autre particules sont explorées, comme les BaTiO3, dans lesquelles il est possible d'inclure des terres rares pour l'émission de fluorecence. Les deux types de particules ont des propriétés non linéaires efficaces pour l'émission de second harmonique, ce qui en fait de bonnes candidates pour les applications de microscopie à deux photons en profondeur. Le dernier axe de travail concerne la modélisation, fabrication et caractérisation de nanosondes hybrides métallo-diélectrique pour l’exaltation des signaux optiques afin de gagner en rapport signal sur bruit et/ou diminuer la puissance d’excitation pour éviter des dommages photo-induits.

Le système optique est monté et en cours de validation pour le suivi en translation des NPs. Une partie du projet est aussi de mesurer l’orientation des NPs en utilisant l’anisotropie d’émission de second harmonique : elle sera implémentée dans les mois à venir.

Les travaux sur les NPs de SiC se sont heurtés au fait que les NP sont fortement agrégées. Plusieurs essais ont été menés pour les désagréger, mais nous n’avons pas encore trouvé de solution fiable. Du point de vue expérimental, nous avons pour l’instant recentré l’étude sur la génération de second harmonique (GSH) afin de continuer les travaux sur la fabrication de nano-sondes hybrides et d’avancer sur le dispositif de microscopie. Nous utilisons pour cela des NP de KTiOPO4 (KTP) ou bien de BaTiO3 (BTO). Les nanoBTO ont par ailleurs été dopés avec des terres rares (Erbium/Ytterbium) qui émettent dans le proche IR, et représentent une alternative aux SiC pour l’objectif de bi-modalité d’émission. Toutefois, l’émission infrarouge (à 1.5 µm pour le dopage à l’Er) reste trop faible.

Le dispositif de caractérisation de GSH des NP au SPEC a permis d’estimer les coefficients non-linéaires de NPs individuelles de KTP, BTO et BTO dopé. Le dopage du BTO réduit l’efficacité de GSH (réduction d’un facteur 2 de l’intensité SHG pour un dopage Er de 0.5%).

Le processus de fabrication des systèmes hybrides cœur-coquille (NP de BTO au cœur et coquille d’or) ont été validés par le LPEM. Des échantillons BTO-Au et KTP-Au devraient être analysés prochainement. Des mesures préliminaires ont permis de vérifier que la coquille d’or n’était pas source d’un signal de SHG additionnel.

Les simulations numériques sur le système cœur-coquille ont été menées à bien, ce qui permet de viser les bonnes géométries pour les meilleurs résultats en termes de brillance d’une part et de limitation de l’élévation de la température d’autre part.

Une campagne va reprendre sur le SiC dans l’année à venir en utilisant cette fois un substrat « wafer » de SiC de poly-type 4H irradié par des protons (pour créer des défauts lacunaires) puis broyé en nanoparticules, à la différence des précédentes expériences menées sur des nanoparticules de polytype cubique.

Les nanoparticules hybrides vont être fabriquées et mesurées.

Nous commençons à préparer le dispositif de microscopie à recevoir des échantillons biologiques (achat d'une enceinte thermalisée et d'atmosphère en CO2 contrôlée en particulier). Le microscope sera testé d'abord sur du transport de nanoparticules dans des puits microfluidiques, puis validé dans des cultures 2D de neurones, avant d'observer des tranches de cerveau de souris ou d'organoïdes cérébraux fabriqués à partir de cellules humaines pluripotentes.

- Intraneuronal transport abnormalities revealed by optically active photostable nanoparticle tracking, IBS conference on advanced optical imaging, Seoul, Corée du Sud, oral invite (F. Marquier, LuMIn, juin 2019)
- Towards 3D single-particle tracking for intraneuronal transport characterization, Live cell single molecule tracking symposium, Ulm, Allemagne, poster (F. Semmer LuMIn, novembre 2019)
- Suivi de nanoparticules en mouvement dans des réseaux de neurones, workshop académique-industriel les nanos pour le vivant, LPS, Orsay, poster (F. Marquier LuMIn, avril 2019)
- Nanoparticle orientation tracking in neuronal networks using second harmonic signal detection, Journée du Labex Nanosaclay, C2N, Orsay, poster (F. Semmer LuMIn, septembre 2019)
- Second-harmonic generation (SHG) of single dielectric nanoparticles for bio-imaging, 25ième Congrès général de la SFP, Nantes, présentation orale (W. DJAMPA TAPI, CEA SPEC Juil (2019))
- Probing intraneuronal transport in vivo with optically active photostable nanocrystals, séminair e invité au LAMBE, EVRY (F. Treussart et F. Marquier, LuMIn, janvier 2020)

SINAPSE is an interdisciplinary project, taking advantage of a large range of expertise at the interfaces of physics, chemistry and neurobiology. The main goal of the project is the development of a novel class of bright crystalline nanoparticles (NPs) with both linear and non-linear optical responses in the near-infrared (NIR) spectral range for bio-imaging applications. More specifically, these nano-labels will be optimized to enable the measurement of intracellular transport parameters in the axon and dendrites of neurons in a 3D neuronal network. Precise quantification of the intraneuronal transport can indeed serve as a readout of genetic risk factor functional impact of neuropsychiatric or neurodegenerative disease, as we already demonstrated in 2D cultures. To this aim, the optically active NPs are spontaneously internalized by neurons, ending up in endosomal vesicles, that are further transported by molecular motors along cytoskeleton tracks. Translational and rotational motion of the NPs will be inferred from two complementary optical signals from the same single particle: NIR fluorescence and second-harmonic generation (SHG), both excited by the same infrared pump laser. The NIR spectral range (excitation, and fluorescence) fits perfectly with the transparency window of biological systems, which is of crucial importance to image deep in brain tissues.

We propose to investigate for the first time the bi-modal optical response that originates from the NIR excitation of silicon carbide nanocrystals (nanoSiC). Compared to the present state-of-the-art of imaging biolabels, nanoSiC has the advantage to allow the two-mode emission: SHG originating from the host matrix and infrared fluorescence originating from crystalline point defects, generated by proton irradiation and thermal annealing. Another key task of SINAPSE project will be to enhance both signals taking advantage of metallic (plasmonic) nanoantennas associated to the nanoSiC, in order to achieve unprecedented large signal-to-noise ratio. The two complementary light-emission processes at the single-particle level will be ultimately used to analyze fine features of the vesicular motion dynamics into 3D neuronal networks, at high spatio-temporal resolution, and large depth (up to ˜100 µm).

SINAPSE gathers 4 complementary skilled partners (Laboratoire Aimé Cotton, CEA-SPEC, Laboratoire Charles Fabry, laboratoire de Physique et d’études des matériaux) who have obtained promising preliminary results. In practice, the project will proceed through three main workpackages corresponding to the three logical axis of the project:
- Production and characterization of the optically-active bi-modal nanoparticles
- Enhancement of the optical properties using plasmonic nanoantennas
- Nanoparticle translational and orientational dynamics measurements into neurons
Our consortium comprises a unique range of expertise in nanochemistry, non-linear optics, nanomaterial science, bioimaging with nanoparticles, and molecular genetics applied to neuropsychiatric/degenerative diseases, required to tackle the ambitious goal of the project. Importantly, the project addresses the challenge of a better understanding of neuropsychiatric/degenerative diseases mechanisms. It could thus have a significant impact on health, in the long run, considering the high prevalence of these diseases worldwide and the limited knowledge regarding the key processes leading to the appearance of the first symptoms. Understanding these processes is essential to develop drugs capable of stopping the disease development at its pre-symptomatic stage.