Reconnaissance séquence-spécifique d'ADN double brin: sondes luminescentes et dommages photo-induits – RECODNA

Les développements récents en biologie et en médecine ont accru l’intérêt pour des outils capables de détecter ou d’endommager spécifiquement un gène. Pour cela, il faut coupler une unité de reconnaissance sélective pour une séquence d’ADN donnée à une unité effectrice capable d’émettre de la lumière ou d’induire un dommage dans l’ADN. Pour la détection d’ADN, la fluorescence est une technique attractive car elle est facile à mettre en œuvre, peu couteuse et elle permet une détection rapide et très sensible. Les agents de dommage à l’ADN capables de cibler spécifiquement un gène sont eux particulièrement intéressants pour des applications en thérapie anticancéreuse et, dans cette optique, des agents photo-activables offrent la possibilité de créer des dommages à l’ADN (oxydation de bases, crosslinks) dans des conditions douces.
Un simple calcul statistique montre qu’une séquence d’ADN de 17 paires de bases est suffisante pour reconnaître sélectivement n’importe quel gène du génome humain. La plupart des méthodes développées jusqu’à présent pour la reconnaissance spécifique d’une séquence d’ADN nécessitent la séparation des brins et l’hybridation du simple brin ciblé avec un brin complémentaire modifié chimiquement, qui est soit un simple brin d’ADN ou soit un oligomère peptide acide nucléique. Cependant, ces méthodes nécessitent des conditions dénaturantes dures avant l’hybridation pour permettre de d’ouvrir le double brin d’ADN, ce qui n’est pas compatible avec une détection d’ADN in vivo en temps réel ou des applications de dommages de gènes. Jusqu’à maintenant, les exemples de systèmes capables de reconnaître sélectivement une séquence précise de double brin d’ADN en conditions non dénaturantes restent rares et ils présentent tous des limitations importantes en ce qui concerne les séquences qu’ils sont capables de reconnaître. Le but de ce projet est d’établir une preuve de concept concernant l’élaboration de sondes luminescentes ou d’agents de dégradation photo-activables pour l’ADN, capables de reconnaître spécifiquement une séquence donnée en conditions non dénaturantes, correspondant à un milieu biologique. Dans ce but, nous allons utiliser, d’une part, des protéines à doigts de zinc pour leurs propriétés de liaison à l’ADN et de reconnaissance spécifique de séquence et, d’autre part des complexes de lanthanides pour leurs fantastiques propriétés de luminescence, particulièrement attractives pour les analyses en milieu biologique. Nous allons concevoir, synthétiser et caractériser des sondes luminescentes ayant une forte brillance, permettant une détection ratiométrique résolue en temps et reconnaissant sélectivement n’importe quelle séquence d’ADN de 18 paires de bases choisie au préalable, ce qui est suffisant pour cibler sélectivement n’importe quel gène humain. Ces sondes seront conçues à partir de protéines qui dimérisent en présence du double brin d’ADN cible. Nous créerons un système FRET en greffant sur ces protéines un complexe de lanthanide et un fluorophore, servant respectivement de donneur et d’accepteur d’énergie. En fonctionnalisant différemment la protéine acceptrice FRET par un photosensibilisateur, nous obtiendrons des agents photo-activables capables d’induire des lésions de l’ADN. Cela permettra, par exemple, d’étudier les dommages que peut engendrer la production d’oxygène singulet, un oxydant puissant connu pour provoquer des lésions de l’ADN, à proximité d’une séquence précise d’ADN.
La force de se projet réside dans la possibilité de modifier facilement ces systèmes basés sur des peptides et des lanthanides pour optimiser leurs propriétés de reconnaissance, de luminescence et leur capacité à engendrer des dommages sur l’ADN. Nous croyons fermement que ce projet établira les bases permettant de développer des outils extrêmement intéressants pour un grand nombre d’applications en recherche biologique ou médicale voire plus tard pour une application thérapeutique.