Etude spatiotemporelle des biofilms électroactifs multi-espèces à l’échelle microscopique par une approche microfluidique et optique – MICROBE

L’échelle d’étude envisagée est très ambitieuse et nous allons y accéder par une approche très originale couplant des méthodes d’électroanalyse et des méthodes optomicrofluidique. En d’autres termes, nous allons concevoir des puces microfluidiques sur des électrodes transparentes et nous allons y faire circuler des liquides biologiques pour former des biofilms électroactifs directement sur les électrodes transparentes.
L’adhésion des bactéries, la colonisation, la structuration tridimensionnelle des biofilms sur les électrodes sera suivie en temps réel par microscopie optique. L’activité électrochimique des cellules adhérées et/ou des biofilms sera monitorée par la mesure en continu du courant d’échange sur la surface des électrodes. Ces méthodes-là ne sont pas destructives des biofilms, elles offrent vraiment la possibilité d’accéder à un suivi dynamique de la structuration physique et de l’activité électrochimique des biofilms.

Les travaux réalisés dans la première partie du projet (18 premiers mois) avaient pour objectif de maîtriser le « scaling-down » des expériences impliquant habituellement des électrodes macroscopiques. Ces travaux a été organisée en deux étapes : La première consistait à réduire la taille des électrodes en mettant en œuvre des microélectrodes dans des réacteurs électrochimiques à grande échelle. Dans un deuxième temps, le système complet a été réduit en développant et en validant le fonctionnement d’un système bioélectrochimique microfluidique.
1. Système bioélectrochimique macroscopique : reproduction du comportement classique de biofilms électroactifs multi-espèces sur des microélectrodes
Dans les systèmes bioélectrochimiques macroscopiques, les profils de production de densité de courant obtenus pour les biofilms sur les microélectrodes ont été observés de la même manière que pour les électrodes à grande échelle. Ils se caractérisent par une phase initiale de latence suivie d'une forte augmentation jusqu'à une valeur maximale, suivie d'une chute du courant et d'une phase finale de stabilisation. La densité de courant maximale était de 10,3 A/m2 pour les biofilms de marais salants et de 11,3 A/m2 pour les biofilms de compost de jardin formés sous polarisation pendant une durée minimale de 30 jours. Dans les deux cas, les microélectrodes en acier inoxydable ont présenté une répétabilité et une reproductibilité des résultats exceptionnelles par rapport aux des microélectrodes en Pt. Cette configuration a permis de définir des paramètres opérationnels à l'échelle microscopique, ainsi que de valider l'utilisation des microélectrodes comme outil d'étude des phénomènes qui se produisent sur des électrodes de plus grande taille.
2. Système bioélectrochimique microscopique : conception étape par étape et validation expérimentale d'une cellule bioélectrochimique microfluidique et transparente
Des électrodes de référence Ag/AgCl fabriquées en laboratoire ont été développées et testées comme électrodes de référence, mais elles ne présentaient pas un potentiel stable pendant de longues périodes, c'est-à-dire plus d'un mois, au contact de fluides biologiques. Un système bioélectrochimique microfluidique à 2 électrodes a été développé par des techniques de lithographie douce et de moulage par injection. Une puce polymère OSTEMER de 110 µL a été assemblée en utilisant un verre conducteur transparent (matériau ITO) comme contre-électrode et pseudo-électrode de référence, et un micro-fil d’acier inoxydable (Ø=50µm) comme électrode de travail. La conception du système bioélectrochimique microfluidique à 2 électrodes permet la polarisation électrique simultanée des microélectrodes, le contrôle du fluide à l'intérieur de la cellule et l'observation en temps réel de la surface des microélectrodes avec un microscope optique à transmission.

Maintenant que les dispositifs d’analyse à petite échelle sont opérationnels, l’influence de plusieurs paramètres va être investigué sur la structure et les performances des biofilms électroactifs multiespèces.
Le choix du potentiel appliqué à l’électrode au démarrage de la formation du biofilm électroactif aura certainement un impact important d’abord sur la physico-chimie de la surface du matériau polarisé puis sur l’attractivité du matériau vis-à-vis des cellules bactériennes. Par la suite, le contrôle du potentiel d'électrode permettra de contrôler le flux d'électrons extraits du biofilm.
La température optimale de croissance et de fonctionnement des espèces bactériennes électroactives dépend du type des bactéries présentes dans l’inoculum. L’objectif sera de définir la température optimale pour assurer le développement des bactéries qui pourraient garantir le meilleur transfert électronique possible.
Les conditions hydrodynamiques, particulièrement le régime d’écoulement et les forces de cisaillement résultantes devraient permettre de gérer la structure du biofilm, et l’activité métabolique des bactéries. Les différentes études menées sur le développement des biofilms en présence de conditions hydrodynamiques variées, montrent que les caractéristiques du biofilm comme la quantité de biomasse adhérée, la production de substances polymériques extracellulaires, la densité et l´épaisseur, varient considérablement suivant le taux de cisaillement imposé.
La gestion du taux d’oxygène dans le biofilm par aération/désaération de l’électrolyte permettra de contrôler l’abondance relative des communautés bactériennes au sein du biofilm. Dans un environnement sans oxygène ou sans autre accepteur final d’électrons soluble, il existe des compétitions pour l’utilisation des substrats organiques entre les populations électroactives et les populations fermentaires. La microaération de l’électrolyte, pendant les phrases critiques où le biofilm électroactif est moins actif, pourrait limiter le développement incontrôlé des populations fermentaires.

Stéphane Pinck, Lucila Martínez Ostormujof, Sébastien Teychené, Benjamin Erable. Microfluidic Microbial Bioelectrochemical Systems: An Integrated Investigation Platform for a More Fundamental Understanding of Electroactive Bacterial Biofilms. Microorganisms, MDPI, 2020, 8 (11), pp.1841. ?10.3390/microorganisms8111841?. ?hal-03078629?

Les biofilms électroactifs sont des biocatalyseurs électrochimiques capables d’extraire sous la forme d’un flux d’électrons (courant électrique) l’énergie chimique contenue dans une large gamme de substrats organiques (effluents, biodéchets, biomasse…). Ils sont aujourd’hui testés dans plus d’une trentaine d’applications catégorisées sous le nom générique de procédés bioélectrochimiques dont les plus connus sont les biopiles, les biocapteurs ou encore les électrolyseurs microbiens. La grande majorité de ces procédés bioélectrochimiques utilisent des biofilms électroactifs environnementaux ou industriels composés d’un mélange de populations de bactéries. Ce type de biofilms mixtes multiespèces offre en théorie des qualités de résilience et d’autoadaptation habituellement très appréciées des industriels pour développer des procédés biologiques efficaces et robustes.
Or, dans le cas des biofilms électroactifs, le caractère « multiespèces » confère aux biofilms une complexité que personne n’est aujourd’hui capable de maitriser. Par exemple, il coexiste au sein des biofilms électroactifs multiespèces des populations bactériennes électroactives et non électroactives qui interagissent et coopèrent ensemble. Les équilibres entre ces deux types de populations sont certainement fragiles et leurs évolutions dépendent à priori de l’évolution (i) du potentiel du matériau sur lequel ils sont établis,(ii) des conditions physico-chimiques dans les strates des biofilms, (iii) de la composition du milieu réactionnel (électrolyte),(iv) des interactions inter-espèces, (v) et des contraintes hydrodynamiques.
C’est à ce type de questionnement scientifique fondamental que nous souhaitons répondre à travers le projet de recherche MICROBE. En effet, nous envisageons d’éclaircir à l’échelle microscopique tout un tas de zones d’ombres concernant les processus et les mécanismes fondamentaux responsables de la formation et de l’évolution des biofilms électroactifs sur la surface des électrodes.
L’échelle d’étude envisagée est très ambitieuse et nous allons y accéder par une approche très originale couplant des méthodes d’électroanalyse et des méthodes optomicrofluidique. En d’autres termes, nous allons concevoir des puces microfluidiques sur des électrodes transparentes et nous allons y faire circuler des liquides biologiques pour former des biofilms électroactifs directement sur les électrodes transparentes.
L’adhésion des bactéries, la colonisation, la structuration tridimensionnelle des biofilms sur les électrodes sera suivie en temps réel par microscopie optique. L’activité électrochimique des cellules adhérées et/ou des biofilms sera monitorée par la mesure en continu du courant d’échange sur la surface des électrodes. Ces méthodes-là ne sont pas destructives des biofilms, elles offrent vraiment la possibilité d’accéder à un suivi dynamique de la structuration physique et de l’activité électrochimique des biofilms. D’autres questionnements clefs comme la « dynamique des populations bactériennes », l’évolution de la « composition chimique » du biofilm (essentiellement les substances exo polymériques) ou encore du « transport de molécules solubles » dans le biofilm, seront également renseignés au cours du projet à des moments importants de la vie des biofilms.
Enfin, nous envisageons d’explorer et de comprendre l’influence à l’échelle microscopique de plusieurs paramètres décrits dans la littérature pour impacter macroscopiquement l’activité électrochimique des biofilms électractifs : le quorum sensing, le flux électronique, la composition et l’hydrodynamique de l’électrolyte.
Pour mener à bien l’approche systémique proposée dans MICROBE, nous avons réuni des compétences complémentaires en microfluidique, électroanalyse, microscopie, microsystèmes et écologie des communautés microbiennes autour d’un consortium de partenaires déjà expérimentés sur la thématique des biofilms électroactifs (LGC Toulouse, LETI Grenoble et LEMiRE Cadarache).