Résonances des fonctions méthylène : des sondes inestimables pour l'étude des protéines – CH2PROBE

Une compréhension fine des événements biomoléculaires nécessite une connaissance des structures moléculaires à la résolution atomique ainsi que la description détaillée de leurs changements conformationnels au cours du temps. En effet, les mouvements internes des biomolécules explorent un large éventail d'amplitudes et de temps ce qui leur confère des fonctions biologiques particulières. La résonance magnétique nucléaire (RMN) représente un outil puissant pour réaliser des études structurales, dynamiques et fonctionnelles des protéines mais elle souffre de deux inconvénients majeurs : elle est peu sensible et les spins nucléaires observés relaxent rapidement. Cela limite fortement la taille des biomolécules qui peuvent être étudiées et la fenêtre de temps accessible aux mesures RMN. Le projet CH2PROBE souhaite démontrer que des protéines sélectivement marquées sur les résidus glycine permettent de contourner efficacement ces deux limitations. En utilisant des expériences de RMN novatrices, nous illustrerons le grand potentiel des résidus glycine qui peuvent s’apparenter à des sondes précises pour l'étude des processus biologiques. Ces nouveaux développements seront effectués sur la protéine Pin1 qui est une peptidyl-prolyl cis-trans isomérase jouant un rôle majeur dans de nombreux processus biologiques. Pin1 a déjà fait l'objet de recherches intensives et de nombreux ligands ont été décrits. Pin1 servira donc de système modèle pour révéler la portée de nos développements RMN, à la lumière de la littérature déjà publiée. Plus précisément, nous montrerons que, à travers les glycines, (i) la sensibilité RMN peut être améliorée même pour des complexes de masse élevée (CH2-TROSY), (ii) de nombreux couplages scalaires et dipolaires peuvent être extraits (Gly-s3NMR), (iii) des états nucléaires à longue durée de vie sont accessibles (LLS) et (iv) des conformations faiblement peuplées peuvent être mise à jour (CEST). Ces mesures seront confrontées à des calculs MD et DFT et devraient nous fournir une vue d'ensemble de la structure et de la dynamique de la dynamique particulière de Pin1. Cette protéine sera également étudiée en complexe avec des ligands que nous concevrons comme des sondes RMN sensibles capables de moduler la structure et la dynamique de leur cible. Ces développements seront basés sur des échantillons de protéines spécifiquement marqués, où tous les acides aminés contiennent des noyaux 2H, 12C et 15N, à l'exception des résidus de glycine. Les protons seront remplacés par du deutérium pour limiter les couplages dipolaires mais nous conserverons les noyaux 15N pour permettre l’acquisition des expériences RMN classiques. Ces marquages seront effectués grâce à un protocole d’expression « cell free ». Une fois optimisé, ce système permettra d'incorporer sélectivement des noyaux marqués au niveau des résidus glycine. En effet, la glycine est commercialement disponible avec une grande diversité de marquages. Nous profiterons donc pleinement de cette opportunité et optimiserons chaque échantillon de protéine en fonction de l’expérience RMN envisagée. Enfin, cette nouvelle possibilité d’introduire des noyaux marqués dans les protéines nous permettra de réaliser des développements de D-DNP. Nous espérons ainsi mettre en évidence une amélioration considérable de la sensibilité RMN pour des échantillons de protéines, à l’instar de ce qui a été observé sur de petites molécules.
Le projet CH2PROBE s'appuiera sur un partenariat solide entre des spectroscopistes RMN (UPMC / ENS, Paris), des biochimistes (IBS, Grenoble), des chimistes organiciens (UCP, Cergy-P) et des chimistes théoriciens (ILL, Lyon). Nous souhaitons ainsi que les méthodes que nous développerons soient applicables à toutes les protéines pour lesquelles les données structurales et dynamiques sont lacunaires ou ne sont pas accessibles à l'aide des méthodes d’étude classiques.