DS05 - Sécurité alimentaire et défi démographique

Décrypter l'hétérogénéité cellulaire et la distribution spatiale de pathogènes dans les matrices alimentaires en interaction avec les communautés microbiennes – PathoFood

Décrypter l'hétérogénéité cellulaire et la distribution spatiale de pathogènes alimentaires bactériens dans des matrices alimentaires en interaction avec les communautés microbiennes

La maîtrise du risque microbiologique au niveau réglementaire est essentiellement basée sur la notion de seuil de contamination qui ne prend pas en compte l’hétérogénéité de la population des pathogènes au sein de l'environnement complexe qu’est l’aliment. L'hétérogénéité phénotypique, observable au niveau de la cellule unique est une caractéristique intrinsèque des bactéries qui doit être prise en compte pour l'évaluation des risques microbiologiques.

Hétérogénéité cellulaire et distribution spatiale de bactéries pathogènes : impact des communautés microbiennes des aliments

Le projet PathoFood vise à comprendre l'hétérogénéité cellulaire et la répartition spatiale de bactéries pathogènes en interaction avec les communautés microbiennes des aliments en caractérisant leur physiologie à l’échelle de leur micro-environnement. En effet, dans une matrice alimentaire, différents micro-environnements coexistent et se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques et biochimiques et leurs communautés microbiennes endogènes. Il vise ensuite à modéliser le comportement de ces bactéries pathogènes en prenant en compte l’écosystème alimentaire. Le projet PathoFood est ciblé sur la caractérisation de deux bactéries pathogènes d'origine alimentaire qui généralement contaminent les aliments à des niveaux initiaux très bas : Escherichia coli O157:H7, comme représentant des E. coli entérohémorragiques (EHEC) et Listeria monocytogenes. En France, ces deux bactéries pathogènes ne représentent que quelques centaines de cas d'infection par an dues à l’ingestion d’aliments contaminés, mais peuvent être responsables de séquelles graves pour les patients. Les produits alimentaires ciblés sont la viande hachée de bœuf et les fromages à pâte molle en raison du risque potentiel et de l’importante hétérogénéité de ces matrices alimentaires. Dans ces matrices complexes, ces pathogènes rencontrent de multiples micro-environnements et peuvent interagir avec les communautés microbiennes en présence.

L’hétérogénéité cellulaire des bactéries pathogènes alimentaires E. coli O157:H7 et L. monocytogenes est étudiée par des approches de microbiologie « cellule unique » basées sur la technique du nombre le plus probable (NPP) en appliquant des plans d'expérience visant à évaluer l’effet de différentes conditions environnementales, telles que le pH, la température, la concentration en acides organiques ou encore la structure de la matrice et le microbiote. La capacité d’adaptation, la croissance et la survie de ces pathogènes sont ainsi évaluées au niveau populationnel et cellulaire dans différentes conditions de micro-environnements rencontrés dans l'aliment. Par ailleurs, la distribution spatiale et l'expression différentielles de gènes d'intérêt sont suivies par des approches de microscopie de fluorescence basées sur l'utilisation de gènes rapporteurs fluorescents. Outre le comportement de ces pathogènes en réponse à différentes conditions représentatives des biotopes alimentaires, les interactions avec les communautés microbiennes (microbiote) des aliments sont aussi étudiées, notamment par des approches basées sur la luminescence comme marqueur de l'état physiologique des bactéries pathogènes. Les paramètres de croissance populationnels et cellulaires des pathogènes ont été ainsi déterminés en interactions avec le microbiote des aliments. Enfin, les données générées sont utilisées pour élaborer des modèles de microbiologie prévisionnelle, en particulier des modèles mathématiques prédictifs stochastiques visant à intégrer le faible niveau de contamination et la notion d'hétérogénéité de comportement des pathogènes alimentaires.

Nous avons pu déterminer l’impact des facteurs abiotiques (température, pH, acides organiques, structure du milieu) sur la probabilité de croissance cellulaire et populationnelle de ces deux pathogènes. La température et le pH ainsi que la structure du milieu présentent les effets les plus importants. Nous avons pu mettre en évidence par différentes approches culturales que ces deux pathogènes pouvaient présenter une meilleure tolérance à certains stress lorsqu’ils sont cultivés dans des matrices modèles gélifiées plutôt que dans des cultures liquides. La colonisation de ces matrices se fait sous forme de cellules isolées sessiles ou motiles ou de micro-colonies de tailles et de formes variables en fonction des milieux. L’utilisation de techniques de fluorescence avancées nous ont permis de visualiser et quantifier l’hétérogénéité cellulaire au sein de ces structures à l’échelle de la cellule unique. Les déterminants moléculaires impliqués dans la colonisation de la matrice alimentaire ont été également étudiés. Par ailleurs, la croissance populationnelle et cellulaire des deux pathogènes a été investiguée en présence de consortia microbien représentatifs des matrices alimentaires étudiées. Les résultats pour les consortia fromagers (bactéries lactiques, d’affinage et levures) montrent que leur présence module fortement la concentration maximale atteinte (Nmax) par les pathogènes. L’impact sur le pathogène dépend de la niche écologique et des taux de population des microorganismes constituant les communautés microbiennes de l’aliment. Les modèles développés pour la croissance cellulaire et les compétitions entre espèces ont été validées sur matrice alimentaire.

Par la suite, les impacts des communautés microbiennes, prédominantes dans la viande hachée et dans le fromage à pâte molle, sur la physiologie et la localisation spatiale de ces deux pathogènes devraient être évalués (en milieu modèle et sur produit). Les données générées sur l’effet de ces différentes interactions seront utilisées pour élaborer des modèles mathématiques prédictifs. Ces modèles seront validés dans les écosystèmes de la viande hachée et du fromage à pâte molle. Une meilleure compréhension des interactions des bactéries pathogènes avec les écosystèmes alimentaires, en prenant en compte le biotope et la biocénose, reste un défi crucial pour prédire l’évolution de ces pathogènes dans les aliments et ainsi améliorer leur sécurité microbiologique. Ce projet représente une première étape cruciale vers une compréhension et une intégration plus avancée de l'hétérogénéité cellulaire dans l'écophysiologie et la microbiologie prédictive des pathogènes alimentaires L. monocytogenes et EHEC.

L’organisation spatiale de bactéries pathogènes alimentaires en matrices alimentaires et l’hétérogénéité d’expression ont principalement donné lieu aux publications et communications suivantes :
-Saint Martin et al. 2022 Genetic, physiological and cellular heterogeneities of bacterial pathogens in food matrices: consequences on food safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. idHAL:hal-03762779
-Dubois-Brissonnet et al. 2022. Genetic, physiological and cellular heterogeneities of bacterial pathogens in food matrices: consequences on food safety. Iseki-food e-conference «Current innovation trends« 23 November 2022. idHAL:hal-03867169
-Saint Martin et al. 2022. Spatial organisation of L. monocytogenes and E. coli O157:H7 cultivated in gel matrices. Food Microbiology. idHAL:hal-03480607
-Saint Martin et al. 2023. Spatially localised expression of the glutamate decarboxylase gadB in E. coli O157:H7 microcolonies in hydrogel matrices. npj Science of Food. idHAL:hal-04242126
Les déterminants moléculaires de bactéries pathogènes alimentaires impliqués dans la colonisation de la matrice alimentaire ont donné lieu aux publications suivantes :
-Ageorges et al. 2020. Molecular determinants of surface colonisation in diarrhoeagenic E. coli: From bacterial adhesion to biofilm formation. FEMS Microbiology Reviews. idHAL:hal-02532777
-Monteiro et al. 2020. The secretome landscape of E. coli O157:H7: Deciphering the cell-surface, outer membrane vesicle and extracellular subproteomes. Journal of Proteomics. idHAL:hal-03103302
-Chafsey et al. 2022. Deep impact of the inactivation of the SecA2-only protein export pathway on the proteosurfaceome of L. monocytogenes. Journal of Proteomics. idHAL:hal-03413889
-Ageorges et al. 2023. Genome-Wide Analysis of Antigen 43 (Ag43) Variants: New Insights in Their Diversity, Distribution and Prevalence in Bacteria. International Journal of Molecular Sciences. idHAL:hal-04064345
-Monteiro et al. 2023. Specific proteomic identification of collagen-binding proteins in E. coli O157:H7: Characterisation of OmpA as a potent vaccine antigen. Cells. idHAL:hal-04138700
Les facteurs environnementaux et les communautés microbiennes alimentaires sur l'hétérogénéité cellulaire de bactéries pathogènes alimentaire ont donné lieu aux communications suivantes :
-Stahl et al. 2021. Quels sont les impacts de conditions abiotiques sur la croissance cellulaire de deux pathogènes alimentaires L. monocytogenes et E. coli 0157:H7 ? SFM Microbes, Nantes, France, 22-24 septembre 2021. idHAL:hal-03735731
-Stahl et al. 2022. E. coli O157:H7 exposée à des consortia microbiens alimentaires : quels impacts sur sa croissance cellulaire ? SFM Microbes, Montpellier, France, 3-5 octobre 2022. idHAL:hal-04193006
-Mangavel et al. 2023. Microbiome engineering as a biopreservation approach to reduce L. monocytogenes in food. BIC 2023, Lille, France 19-21 juin 2023. idHAL:hal-04193008

La maîtrise du risque microbiologique au niveau réglementaire est essentiellement basée sur la notion de seuil de contamination. Ce seuil ne prend pas en compte l’hétérogénéité de la population des pathogènes au sein de cet environnement complexe qu’est l’aliment. En effet, dans une matrice alimentaire, différents microenvironnements coexistent et se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques et biochimiques et leurs communautés microbiennes endogènes. L'hétérogénéité phénotypique, observable au niveau de la cellule unique est une caractéristique intrinsèque des bactéries qui doit être prise en considération pour contrôler les pathogènes d'origine alimentaire. Ainsi, l'évaluation quantitative des risques microbiologiques doit englober la variabilité microbienne. L’objectif du projet est de comprendre l'hétérogénéité cellulaire et la répartition spatiale de bactéries pathogènes en interaction avec les communautés microbiennes des aliments en caractérisant leur physiologie à l’échelle de leur microenvironnement. Il vise ensuite à modéliser le comportement de ces bactéries pathogènes en prenant en compte l’écosystème alimentaire. Le projet PathoFood est ciblé sur la caractérisation de deux bactéries pathogènes d'origine alimentaire qui généralement contaminent les aliments à des niveaux initiaux très bas : Listeria monocytogenes et Escherichia coli O157:H7. Ces deux pathogènes ne représentent que quelques cas d'infection par an dues à l’ingestion d’aliments contaminés, mais sont responsables de séquelles graves pour les patients. Les produits alimentaires ciblés sont la viande avec le steak haché de bœuf et les fromages avec un fromage de type pâte molle en raison du risque microbiologique qu’ils peuvent représenter vis-à-vis d’une contamination à L. monocytogenes et E. coli O157:H7 et de l’importante hétérogénéité de ces matrices alimentaires. Dans ces matrices complexes, ces pathogènes rencontreront de multiples microenvironnements et pourront interagir avec les communautés microbiennes en présence. La capacité d’adaptation, la croissance et la survie de L. monocytogenes et E. coli O157:H7, ainsi que leur hétérogénéité cellulaire et leur distribution spatiale en interaction avec le microenvironnement alimentaire seront caractérisées. De plus, les déterminants moléculaires impliqués dans leur interaction avec les composants de la matrice alimentaire seront identifiés. Les impacts des communautés microbiennes, prédominantes dans un steak haché et chez un fromage à pâte molle, sur la physiologie et la localisation spatiale de ces deux pathogènes seront évalués. Les données générées sur l’effet de ces différentes interactions seront utilisées pour élaborer des modèles mathématiques prédictifs. Ces modèles seront validés dans les écosystèmes du steak haché et du fromage à pâte molle. Une meilleure compréhension des interactions des bactéries pathogènes avec les écosystèmes alimentaires, en prenant en compte le biotope et la biocénose, reste un défi crucial pour prédire l’évolution de ces pathogènes dans les aliments et ainsi améliorer leur sécurité microbiologique.

Coordination du projet

Mickael DESVAUX (Institut National de la Recherche Agronomique, UMR454 Microbiologie, Environnement Digestif, Santé)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Actalia ACTALIA
Adiv ASSOC DEVELOPP INSTITUT VIANDE
Aérial AERIAL
ANSES LSA Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement et du Travail, Laboratoire de Sécurité des Aliments
UL LIBio Universitaire Lorraine Laboratoire d'Ingénierie des Biomolécules
INRA B2HM Institut National de la Recherche Agronomique, UMR1319 Microbiologie de l'Alimentation au servise de la Santé, équipe Bioadhésion-Biofilm, Hygiène des Matériaux
INRA MEDiS Institut National de la Recherche Agronomique, UMR454 Microbiologie, Environnement Digestif, Santé

Aide de l'ANR 790 232 euros
Début et durée du projet scientifique : février 2018 - 48 Mois

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