Décrypter l'hétérogénéité cellulaire et la distribution spatiale de pathogènes dans les matrices alimentaires en interaction avec les communautés microbiennes – PathoFood

L'hétérogénéité cellulaire des bactéries pathogènes alimentaires L. monocytogenes et E. coli O157:H7 est étudiée par des approches de microbiologie « cellule unique » basées sur la technique du nombre le plus probable (NPP) en appliquant des plans d'expérience visant à évaluer l'effet de différentes conditions environnementales, telles que le pH, la température, la concentration en acides organiques ou encore la structure de la matrice. La capacité d’adaptation, la croissance et la survie de ces pathogènes sont ainsi évaluées au niveau populationnel et cellulaire dans différentes conditions de microenvironnements rencontrés dans l'aliment. Par ailleurs, la distribution spatiale et l'expression différentielles de gènes d'intérêt sont suivies par des approches de microscopie de fluorescence basées sur l'utilisation de gènes rapporteurs fluorescents. Outre le comportement de ces pathogènes en réponse à différentes conditions représentatives des biotopes alimentaires, les interactions avec les communautés microbiennes (microbiote) des aliments sont aussi étudiées, notamment par des approches basées sur la luminescence comme marqueur de l'état physiologique des bactéries pathogènes afin de de déterminer. Les paramètres de croissance populationnels et cellulaires des pathogènes sont ainsi déterminés en interactions avec le microbiote des aliments. Enfin, les données générées sont utilisées pour élaborer des modèles de microbiologie prévisionnelle, en particulier des modèles mathématiques prédictifs stochastiques visant à intégrer la notion d'hétérogénéité de comportement des pathogènes alimentaires.

Les premiers résultats du projet permettent de mieux comprendre l’impact des facteurs abiotiques (température, pH, acides organiques, structure du milieu) sur la probabilité de croissance cellulaire et populationnelle de ces deux pathogènes. La température et le pH ainsi que la structure du milieu présentent les effets les plus importants. Nous avons pu mettre en évidence par différentes approches culturales que ces deux pathogènes pouvaient présenter une meilleure tolérance à certains stress lorsqu’ils sont cultivés dans des matrices modèles gélifiées plutôt que dans des cultures liquides. La colonisation de ces matrices se fait sous forme de cellules isolées sessiles ou motiles ou de micro-colonies de tailles et de formes variables en fonction des milieux. L’utilisation de techniques de fluorescence avancées nous ont permis de visualiser et quantifier l’hétérogénéité cellulaire au sein de ces structures à l’échelle de la cellule unique. Les déterminants moléculaires impliqués dans la colonisation de la matrice alimentaire sont également étudiés. Par ailleurs, la croissance des deux pathogènes a été investiguée en présence de consortia microbien représentatifs des matrices alimentaires étudiées. Les premiers résultats pour les consortia fromagers (bactéries lactiques, d’affinage et levures) montrent que leur présence module fortement la concentration maximale atteinte (Nmax) par les pathogènes. L’impact sur le pathogène dépend de la niche écologique des microorganismes constituant les communautés microbiennes de l’aliment.

Par la suite, les impacts des communautés microbiennes, prédominantes dans la viande hachée et dans le fromage à pâte molle, sur la physiologie et la localisation spatiale de ces deux pathogènes devraient être évalués (en milieu modèle et sur produit). Les données générées sur l’effet de ces différentes interactions seront utilisées pour élaborer des modèles mathématiques prédictifs. Ces modèles seront validés dans les écosystèmes de la viande hachée et du fromage à pâte molle. Une meilleure compréhension des interactions des bactéries pathogènes avec les écosystèmes alimentaires, en prenant en compte le biotope et la biocénose, reste un défi crucial pour prédire l’évolution de ces pathogènes dans les aliments et ainsi améliorer leur sécurité microbiologique. Ce projet représente une première étape cruciale vers une compréhension et une intégration plus avancée de l'hétérogénéité cellulaire dans l'écophysiologie et la microbiologie prédictive des pathogènes alimentaires L. monocytogenes et EHEC.

-Monteiro R, Chafsey I, Ageorges V, Leroy S, Chambon C, Hebraud M, Livrelli V, Pizza M, Pezzicoli A, Desvaux M. 2021. The Secretome Landscape of Escherichia coli O157:H7: Deciphering the Cell-Surface, Outer Membrane Vesicle and Extracellular Subproteomes. Journal of Proteomics, 232:104025. DOI: 10.1016/j.jprot.2020.104025
- Darsonval M., Grégoire M., Deschamps J., Briandet R. (2021) Confocal Laser Microscopy Analysis of Listeria monocytogenes Biofilms and Spatially Organized Communities. In: Fox E.M., Bierne H., Stessl B. (eds) Listeria monocytogenes. Methods in Molecular Biology, vol 2220. Humana, New York, NY. DOI: 10.1007/978-1-0716-0982-8_10
-Ageorges V, Monteiro R, Leroy S, Burgess CM, Pizza M, Chaucheyras-Durand F, Desvaux M. 2020. Molecular Determinants of Surface Colonisation in Diarrhoeagenic Escherichia coli (DEC): from Bacterial Adhesion to Biofilm Formation. FEMS Microbiol Reviews, 44:314-350. DOI: 10.1093/femsre/fuaa008

La maîtrise du risque microbiologique au niveau réglementaire est essentiellement basée sur la notion de seuil de contamination. Ce seuil ne prend pas en compte l’hétérogénéité de la population des pathogènes au sein de cet environnement complexe qu’est l’aliment. En effet, dans une matrice alimentaire, différents microenvironnements coexistent et se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques et biochimiques et leurs communautés microbiennes endogènes. L'hétérogénéité phénotypique, observable au niveau de la cellule unique est une caractéristique intrinsèque des bactéries qui doit être prise en considération pour contrôler les pathogènes d'origine alimentaire. Ainsi, l'évaluation quantitative des risques microbiologiques doit englober la variabilité microbienne. L’objectif du projet est de comprendre l'hétérogénéité cellulaire et la répartition spatiale de bactéries pathogènes en interaction avec les communautés microbiennes des aliments en caractérisant leur physiologie à l’échelle de leur microenvironnement. Il vise ensuite à modéliser le comportement de ces bactéries pathogènes en prenant en compte l’écosystème alimentaire. Le projet PathoFood est ciblé sur la caractérisation de deux bactéries pathogènes d'origine alimentaire qui généralement contaminent les aliments à des niveaux initiaux très bas : Listeria monocytogenes et Escherichia coli O157:H7. Ces deux pathogènes ne représentent que quelques cas d'infection par an dues à l’ingestion d’aliments contaminés, mais sont responsables de séquelles graves pour les patients. Les produits alimentaires ciblés sont la viande avec le steak haché de bœuf et les fromages avec un fromage de type pâte molle en raison du risque microbiologique qu’ils peuvent représenter vis-à-vis d’une contamination à L. monocytogenes et E. coli O157:H7 et de l’importante hétérogénéité de ces matrices alimentaires. Dans ces matrices complexes, ces pathogènes rencontreront de multiples microenvironnements et pourront interagir avec les communautés microbiennes en présence. La capacité d’adaptation, la croissance et la survie de L. monocytogenes et E. coli O157:H7, ainsi que leur hétérogénéité cellulaire et leur distribution spatiale en interaction avec le microenvironnement alimentaire seront caractérisées. De plus, les déterminants moléculaires impliqués dans leur interaction avec les composants de la matrice alimentaire seront identifiés. Les impacts des communautés microbiennes, prédominantes dans un steak haché et chez un fromage à pâte molle, sur la physiologie et la localisation spatiale de ces deux pathogènes seront évalués. Les données générées sur l’effet de ces différentes interactions seront utilisées pour élaborer des modèles mathématiques prédictifs. Ces modèles seront validés dans les écosystèmes du steak haché et du fromage à pâte molle. Une meilleure compréhension des interactions des bactéries pathogènes avec les écosystèmes alimentaires, en prenant en compte le biotope et la biocénose, reste un défi crucial pour prédire l’évolution de ces pathogènes dans les aliments et ainsi améliorer leur sécurité microbiologique.