Microscopie super-résolution par localisation de molécules uniques à température cryogénique. – Cryo-PALM

Pour développer de manière rationnelle des protéines fluorescentes phototransformables à basse température, nous utilisons les méthodes de biologie structurale, en particulier la cristallographie des protéines, la micro spectrophotométrie d'absorption et de fluorescence, et les mesures en molécules uniques grâce a un microscope cryo-PALM.
Nos partenaires allemands quant à eux s'intéressent à l'optimisation de la localisation de molécules uniques à basse température en développant une détection sensible à la polarisation, ce qui permet de s'affranchir de l'erreur de localisation du à l'orientation des dipôles des marqueurs fluorescents qui sont fixes à très basse température.

Dans un premier temps, nous avons installé à Grenoble le microscope cryo-PALM qui est une reproduction du microscope développé par nos partenaires allemands en 2016. Pour effectuer ce transfert technologique, une série de difficultés techniques ont dû être surmontées, mais aujourd'hui le microscope fonctionne. En ce qui concerne les protéines fluorescentes phototransformables, nous avons essentiellement concentré nos efforts sur la protéine rsEGFP2, qui est une protéine réversiblement commutable. Nous avons montré que cette protéine est capable de commuter très efficacement à une température de 100 K, et que l'efficacité de cette photo commutation pouvait encore être améliorée en utilisant un laser UV à 355 nm. Des hypothèses sur le mécanisme de commutation ont été proposées et sont actuellement vérifiées par des expériences de cristallographie des protéines afin de déterminer les changements conformationnels impliqués dans ce mécanisme.

Les étapes suivantes vont consister à installer un laser UV sur le microscope cryo-PALM de façon à pouvoir mettre en œuvre cette photo commutation améliorée sur la protéine rsEGFP2. En parallèle nous poursuivons les efforts pour comprendre le mécanisme de photo commutation de cette protéine à basse température. Nous étudions aussi des mutants de la protéine rsEGFP2 qui présentent en principe un contraste de photo commutation encore meilleure. Nous souhaitons aussi investiguer d'autres protéines fluorescentes comme les protéines mEmerald et PAmKate qui ont déjà été utilisé avec succès en cryo-PALM.
Nos collaborateurs allemands quant à eux finalisent actuellement le montage expérimental basé sur la détection de polarisation à basse température, et s'intéressent aussi à la recherche de fluorophores organiques scintillants suffisamment efficacement à basse température pour développer la méthode de cryo-SOFI.

Plusieurs posters et communications orales ont été produites dans des congrès internationaux sur le développement du cryo-PALM.
À Grenoble, nous avons aussi tiré parti des développements concernant l'étude de la photophysique des protéines phototransformables pour produire un travail d'intérêt concernant le sptPALM (PALM avec suivi de molécules individuelles). Ce travail a été publié en août 2019 dans la revue Nature Methods: ( E. de Zitter, D. Thédié, V. Mönkemöller, S. Hugelier, J. Beaudouin, V. Adam, M. Byrdin, L. Van Meervelt, P. Dedecker & D. Bourgeois, Nature Meth., (2019) 16, 707-710)

La microscopie super-résolution a révolutionné la biophysique. En particulier, les méthodes fondées sur le scintillement stochastique des fluorophore (SOFI) ou sur la localisation de molécules uniques (PALM/STORM) sont aujourd'hui très largement utilisés. Nous proposons de combiner les méthodes SOFI et PALM avec la microscopie de fluorescence à température cryogénique afin (i) de permettre l'étude d’échantillons biologiques sous leur forme vitrifiée, préservant ainsi leur intégrité structurale de manière optimale, et (ii) d'ouvrir la porte à la microscopie corrélative optique/électronique à température cryogénique (cryo-CLEM). Une difficulté majeure actuelle provient de l'absence de marqueurs fluorescents, notamment de protéines fluorescentes, qui soient phototransformables efficacement à température cryogénique. Le but principal de ce projet consistera à concevoir et caractériser des protéines fluorescentes qui soient optimisées pour les méthodes cryo-SOFI et cryo-PALM. De plus, nous développerons notre cryo-nanoscope de manière à permettre la localisation de molécules uniques avec une précision sub-nanométrique, et pour mettre en place la microscopie corrélative cryo-CLEM. Cette recherche contribuera à l'essor de la microscopie super résolution, en particulier au bénéfice de la biologie structurale et cellulaire intégrée.