Caractérisation de l’architecture des RCPG à la surface des cellules vivantes par microscopie de force atomique en mode spectroscopie de force à molécule unique – GRApHICS

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs de surface et une cible médicamenteuse majeure (~35 % des médicaments commercialisés). Néanmoins, nombre de ces médicaments présente des effets indésirables pouvant limiter leur utilisation. Pour améliorer l'efficacité/la sécurité de ces médicaments, une meilleure connaissance du fonctionnement moléculaire des RCPGs est indispensable.

La pharmacologie des RCPGs repose classiquement sur un ligand ciblant une molécule réceptrice monomérique. Ces dernières années, l'existence potentielle d'oligomères de RCPGs suscite un vif intérêt, certaines études suggérant que ces oligomères pourraient être impliqués dans des voies de signalisation/fonctions physiologiques spécifiques. Malgré de nombreux travaux, la question de l'existence naturelle de différents états oligomériques des RCPGs à la surface des cellules vivantes et de l’effet des ligands sur cet état ainsi que sur la signalisation associée reste toujours posée.

D'un point de vue technique, les études explorant l'oligomérisation de RCPGs (BRET/FRET, hTRF, Co-IP, LPA, cristaux) ont uniquement mesuré un ensemble de populations de récepteurs sans distinguer les monomères des oligomères. Dans ce contexte, les techniques à l'échelle de la molécule unique représentent un outil de choix pour remédier à cette carence. Leur utilisation pour l’étude de la dynamique d'oligomérisation des RCPGs est récente et repose essentiellement sur la microscopie à molécule unique fluorescente (microcopie TIRF). Bien que le TIRF ait permis de visualiser la dynamique de dimérisation des RCPGs, aucun oligomère d'ordre supérieur ni d'effet de ligands n'a pu être montré, du fait des écueils inhérents à la technique. Pour cette raison, il est nécessaire de développer de nouvelles techniques à l'échelle de la molécule unique pour mieux comprendre l'architecture des RCPGs à la surface cellulaire.
Récemment, la microscopie à force atomique en mode spectroscopie de Force à l'échelle de la molécule unique (SFMS-AFM) a été utilisée pour cartographier différentes molécules à la surface de cellules vivantes à l'échelle nanométrique mais jamais les RCPGs dans des cellules de mammifères. La SFMS-AFM a dernièrement été utilisée pour sonder des RCPGs reconstitués dans des protéoliposomes mais les études en cellules vivantes de mammifères sont encore manquantes, essentiellement du fait des interférences pointe AFM/membrane plasmique. Nous avons récemment fonctionnalisé des pointes AFM avec des anticorps anti-HA et réussi pour la première fois à déplier des RCPGs porteurs d’une étiquette HA exprimés à la surface de cellules de mammifères vivantes. Ainsi, nous avons démontré l'existence naturelle d’oligomères de RCPGs dont l’organisation spatiale est modifiée par l’exposition à différents ligands.

Dans la continuité de ces résultats, et grâce à une collaboration interdisciplinaire incluant biologistes, biophysiciens, chimistes et mathématiciens, le présent projet de recherche de 3 ans vise à étendre l'exploration des RCPGs à la surface des cellules par SMFS-AFM pour:
1/ répondre à des questions biologiques fondamentales et spécifiquement identifier les déterminants moléculaires influençant l'organisation de surface des RCPGs dans les cellules vivantes CHO.
2/ raffiner la chimie de la pointe AFM afin étendre l'utilisation du SFMS-AFM i/ à l’étude des interactions ligand-récepteur à la surface des cellules CHO vivantes, ii/ l’analyse de l'organisation des RCPGs dans des cellules natives.
3/ raffiner le logiciel AFM en automatisant le tri/analyse des distances de déploiement des RCPGs.
4/ raffiner l'analyse mathématique de la distribution/organisation spatiale des oligomères de RCPGs.

Ce projet devrait avoir un impact majeur pour la recherche de futurs médicaments innovants puisqu'il pourrait ouvrir la voie au développement de molécules ciblant des oligomères de RCPGs spécifiques avec une balance bénéfice/risque optimisée.