Le rôle de l'histone H1 et de CENP-C dans la structure et les propriétés épigénétiques de la chromatine – Chrom3D

Les méthodes et technologies utilisées incluent: la biologie moléculaire, l’expression et la purification des protéines, la reconstitution de nucléosomes, la reconstitution des filaments nucléosomiques, la cryomicroscopie électronique, la cristallographie aux rayons X, l’ultracentrifugation analytique, la diffusion à petits angles (SAXS), la réticulation chimique, “DNA footprinting”, des essais de retard sur gel, la microscopie à fluorescence, la co-immunoprécipitation et la protéomique.

Nous avons déterminé la structure 3D d'un filament de six nucléosomes lié à H1 à une résolution de 9,5 Å par cristallographie et avons validé la structure par cryo-EM et analyse biochimique. La structure révèle une conformation étonnamment plate dont la densité de nucléosomes n’est que la moitié de celle de la fibre de chromatine de 30 nm. À l'aide de l'analyse cryo-EM et biophysique, nous avons montré qu'un changement mineur des conditions ioniques incite l'ensemble à adopter une conformation plus compacte et tordue qui correspond à celle de la fibre de 30 nm, apportant une lumière importante sur la plasticité structurelle de la chromatine. Ces travaux ont récemment été publiés (Garcia-Saez et al., Mol Cell 2018, PMID 30392928). De plus, nous avons reconstitué une particule nucléosomique (NCP) CENP-A en utilisant la séquence d'ADN Widom 601 et en avons déterminé la structure par cryo-EM en utilisant une plaque de phase Volta à une résolution de 4 Å. Étonnamment, la structure a révélé que le bras droit de l'ADN est considérablement plus désordonné (plus flexible) que le bras gauche. Un manuscrit décrivant ce résultat est actuellement en préparation. Nous avons étudié l'insertion de deux résidus dans la boucle L1 qui différencie CENP-A de l'histone H3. Nous avons montré que le remplacement in vivo de CENP-A par des mutants L1 compromet l'association de plusieurs composants du kinétochore avec les nucléosomes de CENP-A et induit de graves défauts mitotiques et cytocinétiques, mettant en évidence l'insert de L1 en tant qu'épitope crucial pour le recrutement des kinétochores. De plus, la déplétion de CENP-A dans des cellules HeLa a conduit à une délocalisation massive de CENP-C des centromères. La localisation de CENP-C pouvait être sauvée par CENP-A de type sauvage mais pas par les mutants L1 de CENP-A, démontrant que la boucle L1 est essentielle pour une localisation et un fonctionnement correct de CENP-C sur les centromères.

La découverte qu'un changement mineur dans les conditions ioniques amène le filament de 6 nucléosomes à passer d'une conformation étendue et plate à une conformation plus compacte qui correspond à celle de la fibre de 30 nm est une découverte passionnante. Ces résultats fournissent des informations importantes sur la voie d'assemblage de la fibre de 30 nm. De plus, ils révèlent comment un changement mineur de l'environnement local (pouvant par exemple être généré par la modification post-traductionnelle des histones) peut induire un changement radical de la conformation de la chromatine, éclairant la plasticité structurelle de la chromatine qui est au cœur de la réglementation de l'expression des gènes.

1. Garcia-Saez I, Menoni H, Boopathi R, Shukla MS, Soueidan L, Noirclerc-Savoye M, Le Roy A, Skoufias DA, Bednar J, Hamiche A, Angelov D, Petosa C, Dimitrov S. (2018) Structure of an H1-Bound 6-Nucleosome Array Reveals an Untwisted Two-Start Chromatin Fiber Conformation. Molecular Cell 72:902-915
doi.org/10.1016/j.molcel.2018.09.027

2. Sharma AB, Dimitrov S, Hamiche A, Van Dyck E. (2018) Centromeric and ectopic assembly of CENP-A chromatin in health and cancer: old marks and new tracks. Nucleic Acids Res 47:1051-1069.
doi.org/10.1093/nar/gky1298

La structure d'un nucléosome complet (incluant l'ADN de liaison et l'histone de liaison H1), l'organisation tridimensionnelle de la fibre de chromatine de 30 nm et la structure de la chromatine centromérique représentent des problèmes clés dans le domaine de la chromatine et de l'épigénétique. De plus, la manière dont la chromatine centromérique, caractérisée par des nucléosomes contenant CENP-A, l’histone variant de H3, recrute la protéine centromérique CENP-C pour enclencher l'assemblage du kinétochore est mal comprise. Les travaux proposés pour aborder ces questions feront avancer notre compréhension de la biologie fondamentale de la chromatine et éclaireront les mécanismes moléculaires qui sous-tendent des maladies génétiques et épigénétiques spécifiques.

Objectifs : Ce projet vise à obtenir des données structurelles tridimensionnelles sur le nucléosome en association avec H1, la fibre de chromatine de 30 nm, et la chromatine CENP-A, et à déchiffrer la manière dont CENP-C reconnaît spécifiquement la chromatine CENP-A.

Méthodologie : Nous reconstituerons des mono-nucléosomes en utilisant des histones de cœur recombinantes, différentes isoformes de l'histone de liaison H1 et de l'ADN portant une forte séquence de positionnement nucléosomique. Nous déterminerons les structures par cristallographie aux rayons X et par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) en exploitant les derniers développements technologiques. Nous validerons ces structures par empreinte («Footprinting») de l'ADN et par une nouvelle technique de « cross-linking » combinée à la qPCR, développée par notre consortium appelée «Identification des nucléosomes voisins les plus proches» (ICNN).

Consortium: Le projet est une collaboration interdisciplinaire impliquant cinq équipes de recherche situées à Grenoble, Lyon et Strasbourg. Les travaux envisagés représentent un effort global qui combine l'expertise dans la biologie structurale, biochimie, biophysique et biologie cellulaire de la chromatine.

Résultats attendus et impact : Ce projet devrait mener à de nouvelles connaissances concernant la structure de la chromatine, les rôles de l'histone H1 et de CENP-A dans l’organisation de la structure de la chromatine, et les interactions entre la chromatine CENP-A et CENP-C. Cette connaissance fondamentale est indispensable pour comprendre l'organisation du génome ainsi que les mécanismes génétiques et épigénétiques qui sous-tendent d’importants processus nucléaires, y compris l'expression génique, la réplication de l'ADN, la réparation de l'ADN et la mitose.

Pertinence biomédicale : Comprendre la structure d'ordre supérieur de la chromatine ainsi que le rôle régulateur joué par les histones de liaison et par CENP-A est essentiel pour appréhender les bases moléculaires de plusieurs maladies graves. Les altérations de la chromatine CENP-A sont associées à des aberrations chromosomiques sévères ainsi qu'à une cytokinésie perturbée. Celles-ci peuvent conduire à l'aneuploïdie méiotique, une cause majeure d'avortements spontanés, d'infertilité et de malformations congénitales, comprenant les syndromes de Down, d’Edwards et de Patau qui affectent une proportion significative de nouveau-nés chaque année. Ces travaux devraient améliorer nos connaissances des mécanismes moléculaires fins dont résultent ces maladies.