Une approche microfluidique générique pour la qualification des nanoparticules biologiques – MADNESS

Une première génération de dispositifs de séparation a été conçue. Elle cible, dans un premier temps la collecte des vésicules dont le diamètre est inférieur à 700nm ce qui correspond à la population majoritaire des vésicules plaquettaires.
En parallèle le développement du module de nanobioanalyse a été engagé. Il a été conçu sous la forme d’une puce à micro-arrays d’anticorps, intégrée dans un module microfluidique compatible avec le module de tri. Il reproduit les paramètres d’utilisation d’une puce SPR, c’est-à-dire un fonctionnement à basse pression (10mbar) donc faible débit et un faible volume d’injection (3µL). La fonctionnalisation chimique de la puce de capture utilise une technologie à base de monocouches autoassemblées greffées sur une surface d’or développée spécifiquement à FEMTO-ST.

. Les premières expériences ont démontré une capture efficace et sélective des calibrants et leur possible observation par AFM à la suite de l’étape de capture. Des premiers essais associant de façon continue les 3 étapes (séparation, capture et analyse par AFM) oLes dispositifs de tri ont été réalisés en salle blanche sur la base d’une technologie de laminage de films polymères (epoxy) secs. Nous avons validé la séparation et le respect des spécifications à l’aide de solutions de billes calibrées synthétiques de diamètres 200, 500 et 1000 nm. La séparation est opérationnelle à basse pression (<2bars) même en milieu très concentré (2.109 to 2.1011 particules/mL) et nous avons démontré qu’elle n’était pas sensible aux fluctuations de pression ou de débit ce qui en fait un principe robuste. Afin d’augmenter le volume filtré (nous visons 35µL en 15 min), nous avons conçu un dispositif plus complexe (100 canalisations de collecte de l’échantillon filtré, puce de 4x2cm) faisant intervenir le maillage de canalisations réalisées sur 2 niveaux différents. Cette structure a nécessité l’adaptation du procédé de fabrication. Les puces sont en cours de test. Un dispositif à plus faible diamètre de coupure (200 nm correspondant à la limite supérieure des exosomes) a également été conçu. La possibilité d’utiliser un gradient thermique pour préconcentrer les vésicules avant filtration est en cours d'étude théorique. La preuve de concept de la bio-capture a été effectuée en utilisant des microbilles (calibrants de 480 et 920 nm) biofonctionnalisés de manière à mimer la capture des vésicules biologiques à la surface de la biopucent été effectués avec succès démontrant la faisabilité de l’approche.

Le travail se poursuit par une étude sur échantillons biologiques. De même, le dispositif à plus faible diamètre de coupure (200 nm correspondant à la limite supérieure des exosomes) sera validé de la même manière dans les mois qui arrivent. En fonction des résultats théoriques sur la pré-concentration thermophorétique, cette solution sera implémentée dans les puces microfluidiques.
En ce qui concerne le module de piégeage, le travail s’oriente donc maintenant d’une part sur l’optimisation des conditions opératoires et d’autre part sur le traitement d’échantillon réels.

L. Pillemont, D. Guneysu, C. Elie-Caille, W. Boireau and A.-M. Gué. Towards on-chip EVs separation: a lab-on-chip approach. J Extracell Vesicles. 2019; 8(Suppl 1): 1593587, p 310. doi: 10.1080/20013078.2019.1593587
L. Pillemont, D. Guneysu, C. Elie-Caille, W. Boireau and A.-M. Gué A generic Microfluidic Approach for Deciphering Nanoscale biovesiclES propertieS, 3rd Caparica Conference on Sample Pretreatment, Caparica, Portugal, 3-6 December 2018
L. Pillemont, D. Guneysu, C. Elie-Caille, W. Boireau and A.-M. Gué Towards on-chip EVs separation: a lab on chip approach, Annual Meeting of the International Society of Extracellular Vesicles (ISEV), 24-28 april 2019, Kyoto, Japan
Obeid S., Sung, P-S., Le Roy B., Chou M-L., Shieh S-L., Elie-Caille C., Burnouf T., Boireau W. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: a tool to improve transfusion safety. NANOMEDICINE: NANOTECHNOLOGY, BIOLOGY, AND MEDICINE 2019
B. Namasivayam, Yu-Wen Wu, L. Delila, A. Frelet-Barrand, T. Burnouf, C. Elie-Caille and W. Boireau. The nanobioanalytical platform, a tuneable tool for a sensitive detection & characterization of extracellular vesicles subsets from biological samples. J Extracell Vesicles. 2019; 8(Suppl 1): 1593587, p 82. doi: 10.1080/20013078.2019.1593587
Thery C, C Elie-Caille, A Frelet-Barrand, W Boireau et al, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines, J Extracell Vesicles 2018, VOL. 8, 1535750
B. Namasivayam, Wu Yu-Wen, L. Delila, A. Frelet-Barrand, T. Burnouf, C. Elie-Caille, W. Boireau. The Nanobioanalytical Platform, a tuneable tool for a sensitive detection/characterization of extracellular vesicles subsets from biological sample. Annual Meeting of the International Society of Extracellular Vesicles (ISEV2019), Kyoto, Japan, 24-28 april 2019

Les microvésicules extra cellulaires (EVs) sont des vésicules de taille submicrométrique libérées dans les conditions physiologiques par pratiquement toutes les cellules du corps. Elles circulent dans les fluides corporels et sont de plus en plus considérées comme de prometteurs marqueurs de pathologies (biomarqueurs). Ainsi, identifier et caractériser ces vésicules pourrait ouvrir de nouveaux axes de diagnostic/pronostic pour un très grand nombre de pathologies. En raison de leur hétérogénéité en taille, en origine et en concentration, il n’existe, à l’heure actuelle, aucune technique idéale permettant de quantifier et caractériser ces microvésicules et de relier complètement leur structure à leurs fonctions. En effet, toutes les méthodes disponibles aujourd’hui (cytométrie en flux, DLS, NTA, TPRS, …) présentent des limites dans leur capacité à investiguer toute la diversité des populations de microvésicules en termes de taille, expression des marqueurs membranaires et relations structure-fonction. Ainsi, seule une combinaison de techniques peut permettre d’accéder à l’ensemble des informations nécessaires à l’évaluation des EVs. De plus, les méthodes actuelles sont peu propices à l’automatisation de l’analyse sur un grand nombre d’échantillons. Toutes ces difficultés constituent autant de verrous qui retardent les progrès en recherche fondamentale autant que les avancées décisives dans le domaine du diagnostic/pronostic. Dans ce contexte, l’objectif général de ce projet est de développer une plateforme miniaturisée permettant l’isolement, le fractionnement et la classification des EVs. Nous proposons une approche microfluidique couplant un module de séparation hydrodynamique avec des chambres d’analyse et de réaction. Le module microfluidique effectuera la séparation en taille dans la gamme 0-500nm où la cytométrie en flux ne peut opérer. Nous proposons d’interconnecter à chaque canalisation de collecte un micro-immuno-array (ou ligands) afin de procéder à la capture spécifique et multiplexée des EVs puis à la caractérisation nanométrologique par AFM des espèces piégées.
A la suite, chaque échantillon séparé puis « screené », sera collecté en sortie afin d’être qualifié et quantifié par une approcha multi-omique par couplage aux techniques de spectrométrie de masse disponibles dans notre environnement technologique. Bien que ce projet soit centré sur le développement instrumental, nous proposons d’effectuer la preuve de concept sur le cas représentatif des microvésicules plaquettaires (PMVs). Selon le stimulus responsable de leur production, les PMVs exercent une fonction différente (i.e. capacité à stimuler ou non les cellules endothéliales, les cellules dendritiques, …). Cette propriété sera utilisée comme grille de lecture fonctionnelle pour analyser les fractions de PMVs séparées. Cette approche multiparamétrique et multifonctionnelle ouvrira la voie à une instrumentation générique pour la qualification des bio nanoparticules et permettra de nouveaux tests à visée diagnostique ou pronostique.
Le projet MADNESS rassemble l’expertise scientifique complémentaire de 3 laboratoires de recherche : le LAAS-CNRS (microfabrication et micronanofluidique), l’intitut FEMTO-ST (microfabrication et nanobioanalyse) et l’UM1098 (Etablissement Français du Sang- INSERM-Université Franche Comté) (bioanalyse et biologie).