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Chemo-biologie pour la characterization structurale et fonctionnelle de complexes ARN-protéines – SyntRNA

Chemo-biologie pour la caractérisation structurale et fonctionnelle de complexes ARN-protéines

L’objectif général de la proposition est le développement de méthodologies post-synthétiques pour la fonctionnalisation des ARN. L'ARN sera fonctionnalisé par des groupes réactifs, tels que des groupes électrophiles ou photo-activables, ainsi que par des sondes fluorescentes. Grâce à cette stratégie de post-fonctionnalisation, nous obtiendrons une grande variété d’analogues d’ARNt qui seront utilisés pour la caractérisation structurale et fonctionnelle des complexes ARN-protéine.

Développement de méthodologies post-synthétiques pour la fonctionnalisation des ARN qui seront utilisées pour la caractérisation structurale et fonctionnelle des complexes ARN-protéine

Pour comprendre la biologie des ARN, il est nécessaire de développer de nouvelles méthodologies de synthèse pour modifier leurs structures. Notre objectif concerne la mise au point de méthodologies post-synthétique pour bi-fonctionnaliser des ARN et obtenir ainsi des ARN réactifs ou comportant des sondes permettant leurs détections et leurs purifications. Dans ce projet, nous allons synthétiser des ARNt fonctionnalisés, qui seront utilisés pour explorer leurs interactions avec les amino-acyltransférases de la famille Fem, enzymes qui catalysent une étape essentielle de la synthèse du peptidoglycane de la paroi de Staphylococcus aureus.

Pour le développement de méthodologies post-synthétiques pour la multi-fonctionnalisation des ARN, nous avons choisi deux réactions orthogonales, qui permettent l’incorporation spécifique de deux groupements différents: la ligation de Staudinger « traceless » et la réaction de couplage de Suzuki-Miyaura catalysée par le palladium. Ces réactions constituent de nouvelles approches attrayantes pour la modification des ARN. Grâce à la ligation de Staudinger, une liaison amide entre le groupement d’interet et l'ARN sera générée. L'introduction d'un second groupement sera obtenue par la réaction de couplage de Suzuki-Miyaura, cette réaction générera une liaison carbone-carbone. Dans notre projet, l'une des deux substituant sera un groupe électrophile, tel que les accepteurs de Michael, pour la formation de produits d'addition covalents ARN-protéine. Nous envisageons également d'utiliser des groupes photo-activables, tels qu'une benzophénone ou des diazirines. L'autre groupement sera une biotine pour la purification par affinité et un fluorophore pour la détection et la purification des adduits covalents ARN-protéine. Pour explorer la réactivité et la sélectivité des ARN fonctionnalisés par les groupes électrophiles, nous allons générer des adduits covalents entre les ARNt et les aminoacyl-transférases FmhB, FemA, qui sont essentiels à la biosynthèse du peptidoglycane de la paroi cellulaire bactérienne chez Staphylococcus aureus. Cela donnera accès à l’identification des résidus catalytiques sur la base de leur réactivité atypique ou à l’interface ARN-Fem basée sur des réactions induites par la proximité. Cette approche générera des adduits d'ARN-Fem stables pour la cristallogenèse et la détermination de structure RX. Les ARN fonctionnalisés seront également utilisés pour identifier des protéines inconnues interagissant avec des aminoacyl-ARNt qui sont des substrats préférentiels des Fem transférases.

Au cours de la première période de ce contrat, deux nouvelles familles d’ARNt modifiés ont été obtenues : des ARNt contraints et des conjugués. Ces molécules ont été utilisées pour étudier des amino-acyltransférases de la famille Fem :
- Synthèse et évaluation biologique des ARNt contraints. Pour étudier la préférence conformationnelle des Fem transferases pour le nucléotide terminal des ARNt, les partenaires 1 et 2 ont synthétisé deux analogues d’ARNt contenant un ribose terminal verrouillé dans une conformation de type S. Ces ARNt verrouillés ont été évalués en tant qu'inhibiteurs de FemXWv, révélant que cette transférase affichait une préférence modérée pour les ARNt contenant un A76 terminal bloqué dans la conformation Sud. Au-delà de l'analyse des Fem transferases, la nouvelle voie de synthèse développée dans ce travail donne accès à des analogues d'ARN d'un grand intérêt pour l'étude de la préférence conformationnelle des protéines interagissant avec l'ARNt.
-Synthèse et évaluations biologiques de conjugués lipides-glucides-peptidyl-ARN. Les conjugués lipide-glucides-peptidyl-ARN ont été obtenus par les partenaires 1 et 2 en combinant des réactions de post-fonctionnalisation, la synthèse en phase solide et des réactions enzymatiques. Les mimes de Gly-tRNAGly et de l’intermédiaire lipidique II ont été combinés dans un seul «bi-substrat« qui inhibe la transferase FmhB avec un IC50 de 56 nM. Ensuite, le D-Ala a été remplacé par un D-Lac à l'extrémité C-terminale du peptide, une modification responsable de la résistance acquise à la Vancomycine chez les entérocoques et chez S. aureus. La substitution a gravement compromis la reconnaissance des précurseurs du peptidoglycane par FmhB. Cette diminution d’affinité peut expliquer la dissémination limitée des gènes de résistance à la vancomycine chez S. aureus.

Nous travaillons actuellement sur la synthèse d'ARNt fonctionnalisés par réaction de Staudinger sans trace et par réaction de Suzuki-Miyaura.

1. « Synthesis of tRNA analogues containing a terminal ribose locked in the South conformation to study tRNA-dependent enzymes ». L. Iannazzo, M. Fonvielle, E. Braud, H. Hrebabecky, E. Prochazkova, R. Nencka, C. Mathé, M. Arthur, M. Etheve-Quelquejeu, Org. Biomol. Chem., 2018, 16, 1903 - 1911.
2. « Synthesis of lipid-carbohydrate-peptidyl-RNA conjugates to explore the limits imposed by the substrate specificity of cell wall enzymes on the acquisition of drug resistance», Fonvielle M., Bouhss A., Hoareau C., Patin D., Mengin-Lecreulx D., Iannazzo L., Sakkas N., El Sagheer A., Brown T., Ethève-Quelquejeu M., Arthur M., Chem. Eur. J., 2018, 24:14911-14915.

En plus de ses fonctions clés dans la synthèse des protéines et dans la régulation des gènes, de nouvelles propriétés des ARN sont constamment découvertes. Pour comprendre la biologie des ARN, il est nécessaire de développer de nouvelles méthodologies de synthèse pour modifier leurs structures. Notre objectif concerne la mise au point de méthodologies post-synthétique pour bi-fonctionnaliser des ARN et obtenir ainsi des ARN réactifs ou comportant des sondes permettant leurs détections et leurs purifications. Les réactions chimiques que nous allons utiliser seront la ligation de « Staudinger traceless » et un couplage pallado-catalysé de Suzuki-Miyaura. Ces réactions donneront la possibilité d'obtenir une grande variété d'ARN bi-fonctionnels qui présenteront un large intérêt dans l’étude de la biologie des ARN. Dans le projet, ces ARNt fonctionnalisés seront utilisés pour explorer l’interaction des ARNt avec les amino-acyltransférases de la famille Fem, enzymes qui catalysent une étape essentielle de la synthèse du peptidoglycane de la paroi de Staphylococcus aureus. Chez cette bactérie pathogène, une chaîne latérale penta-glycine est assemblée par trois transférases qui ajoutent séquentiellement un (FmhB) ou deux (FemA and FemB) résidus Gly. Un premier objectif sera de synthétiser un analogue stable Gly-tRNAGly contenant un fluorophore à diverses positions des boucles D et T de l’ARN. La synthèse s’effectuera à partir d’un azido-ARN, qui réagira via la ligation de Staudinger traceless, avec une phosphine comportant le motif glycine pour former une liaison amide. L'introduction du fluorophore sera basée sur le couplage de Suzuki-Miyaura entre un iodo-ARN et un acide boronique lié au fluorophore. Le précurseur iodo-azido-ARN sera obtenu par chimie des nucléosides suivie d'une étape de synthèse sur support solide et d'une ligation enzymatique. Les ARNt bi-fonctionnalisés seront utilisés pour étudier le mode de reconnaissance des iso-accepteurs spécifiques des Gly-tRNAGly qui participent préférentiellement à la synthèse du peptidoglycane plutôt qu’à la synthèse protéique. Des données préliminaires suggèrent que l'utilisation préférentielle d'iso-accepteurs est due à des interactions spécifiques entre les boucles D/T des ARNt et le domaine coiled-coil de FmhB. Pour explorer ces interactions, un quencher de fluorescence sera introduit à différentes positions du coiled-coil de FmhB. Une diminution du signal de fluorescence de notre ARN bi-fonctionnalisé sera observée si le fluorophore dans la boucle D/T est à proximité du quencher porté par FmhB. Notre méthodologie de post-fonctionnalisation donnera la possibilité de modifier facilement la position du fluorophore et du quencher. Un test basé sur le quenching de fluorescence sera développé pour déterminer l'affinité de FmhB pour des ARN non-marqués. Pour une deuxième application, un motif électrophile sera introduit à l'extrémité 3' de l'ARNt pour générer des liaisons covalentes avec des résidus du site actif de FmhB. Cette approche permettra d’explorer la réactivité des résidus catalytique de FmhB et également de produire des complexes stables ARN-FmhB pour une utilisation en cristallogenèse. Les ARNt électrophiles seront également utilisés comme sondes pour identifier des protéines inconnues qui interagissent avec le substrat ARNt de FmhB, telles que des enzymes de maturation d'ARNt. Une dernière partie du projet concernera la processivité de la transférase FemA, c'est-à-dire la capacité de l'enzyme à ajouter deux résidus Gly. Nous avons envisagé trois modèles pour cette réaction incluant le transfert séquentiel de Gly à la chaîne latérale en croissance ou à l'assemblage d'un motif Gly-Gly sur l'ARNt ou sur FmhB avant le transfert au précurseur du peptidoglycane. Pour étudier ces modèles, nous allons générer divers analogues Gly-ARNt stables, en particulier un analogue de Gly-Gly-tRNAGly.

Coordinateur du projet

Madame Mélanie Etheve-Quelquejeu (Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UPDESCARTES-LCBPT Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques
INSERM-UMRS1138-CRC-Equipe 12 CENTRE DE RECHERCHE DES CORDELIERS
CNRS DR IDF SECTEUR SUD

Aide de l'ANR 470 267 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2017 - 36 Mois

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