DS04 - Vie, santé et bien-être

Rupture et réparation membranaire : stratégies d’assemblage virale – membrane dynamics

The objective of the proposal is to analyse the role of both lipids and viral proteins in the unconventional membrane assembly of the poxvirus vaccinia virus (VACV). During membrane assembly small vesicular carriers are recruited to the assembly site, these are opened via membrane rupture and contribute to the assembly of the viral inner membrane by fusion. The proposed working plan was based on two pieces of evidence; first the observation made in 2013 that the viral membrane is enriched in several lipid species among which phosphatic acid (PA) and phospho-inositides (PI). Second was the observation, based on characterization of a conditionally expressing recombinant VACV, that in the absence of a single VACV protein, the gene product of A11, membrane rupture does not occur and hence viral membrane assembly is blocked (Suarez et al., 2017). Thus, we proposed to study the role of lipids (PA and PI) and of A11 further both in vivo as well as in vitro. In vitro we planned to express A11 in liposomes of defined lipid composition and analyse effects on membranes (eg. Rupture) biochemically and by high-resolution cryo-EM.

We carried out a study showing an important role the protein A11 in membrane biogenesis of VACV (Suarez et al., 2017). When A11 is not expressed VACV morphogenesis is blocked; by electron tomography we could show that this inhibition is due to the fact that cellular membranes are not ruptured providing an important piece of evidence for the fact that membrane rupture is a prerequisite for viral assembly. Recent publications on VACV proteins involved in membrane assembly have identified a complex of five minor membrane associated proteins with important roles in membrane biogenesis. Among these are the gene products of A11, A6, H7, L2 and A30,5. Together with the group of Fasseli Coulibaly, a collaborator on this proposal, we have started to purify these proteins individually and expressed them in liposomes with defined lipid composition. This has shown that at least two of these VMAPs require specific lipid composition to associate with membranes and both of these two VMAP considerably modify membranes. These preliminary results will now be used to solve their structure by cryo-EM. The other three proteins are either not cloned yet or present complications when expressed in E. coli. The characterization of these three proteins is thus work for the future.
In order to study the function of these five proteins in infected cells we wish to establish complementation assays.
To test for a role of lipids in infected cells we have carried out drug experiments with little results so far. Hence, we have turned towards the localization of lipids with respect to the virally modified membranes by light microscopy. We put a specific emphasis on PA and PI using lipid binding probes bound to GFP. This study is currently underway with some preliminary encouraging results.

continue the work as described under main results

no patents
several peer reviewed publications, one submitted for publication

Résumé de soumission

Resume

Les cellules eucaryotes contiennent des compartiments membranaires qui communiquent entre eux par l’intermédiaire de vésicules dont le transport est controlé par un ensemble de protéines spécifiques. Les virus, parasites intracellulaires obligatoires, acquièrent leur membrane de l’hote par un mécanisme imitant la formation de vésicules. La famille des grands virus nucléocytoplasmique à ADN (NCLDVs) fait exception à cette règle et suit une voie non-conventionnelle pour acquérir sa membrane. Pendant l’infection des ruptures de membrane sont induites, des intermédiaires membranaires ouverts se forment, à partir desquelles se crée une structure membranaire sphérique ouverte. Cette dernière est ensuite modelée par une protéine virale d’échafaudage conservée dans la famille des NCLDVs. La sphère membranaire reste ouverte jusqu’à ce que le génome viral intègre la structure ce qui déclenche la fermeture des membranes et la transformation en virion infectieux. Nous proposons que cet assemblage peu commun de membranes soit controlé, dans la famille des NCLDVs, par un mécanisme qui implique des protéines (virales) et des lipides. Ensemble ils interviendraient dans les ruptures de membrane, la stabilisation des extrémités coupées, la formation de sphère ouverte et la fermeture après intégration du génome.
Nos récentes analyses par spectrométrie de masse de virus de la vaccine (VACV, membre de la famille des NCLDVs) montrent que l’enveloppe du virus est enrichie en composés lipidiques qui ont été impliqués dans la rupture et la déstabilisation de membrane. De plus des résultats préliminaires obtenus par tomographie électronique (ET) ont permis d’identifier une protéine de VACV, nécessaire à la rupture des membranes dans les cellules infectées. Dans le cadre de ce projet nous rechercherons des protéines partenaires qui interagiraient avec la protéine de VACV identifiée. La protéine de VACV connue sera exprimée et purifiée avec et sans protéines partenaires et les structures seront analysées par microscopie électronique à froid et par cristallographie aux rayons X. Pour cette dernière nous travaillerons en collaboration avec le Dr. Coulibaly (Monash, Melbourne), expert en cristallographie de protéines virales, en particulier de protéines de VACV. En parallèle nous continuerons l’analyse lipidique pour identifier les composés lipidiques mineurs et les classes de lipides spécifiques associés au VACV purifié. Nous proposons de complémenter ces données par une analyse en spectrométrie de masse de structures de membranes ouvertes de VACV isolées et purifiées à partir de cellules infectées. Le role de lipides spécifiques impliqués dans la rupture de membrane sera déterminé in vitro et in vivo. In vitro la protéine de VACV nécessaire à la rupture sera insérée dans des membranes artificielles (liposomes) reconstituées à partir des lipides identifiés par spectroscopie de masse comme étant enrichis dans la membrane virale. L’effet de la protéine sur les liposomes sera analysé par libération du contenu et tomographie électronique à froid. In vivo nous chercherons à inhiber la synthèse de lipides spécifiques dans les cellules infectées et jugerons des effets produits sur l’assemblage de VACV par tomographie électronique.
Nos études vont aider à comprendre les mécanismes de rupture membranaire ainsi que leur réparation et pourraient trouver des applications dans le domaine de transport ciblé de composés dans les cellules. Il serait aussi possible de comprendre pourquoi ce mécanisme qui, rare chez les eucaryotes d’aujourd’hui, était présent chez les eucaryotes/archées/bactéries, a été perdu pendant l’évolution.


















Coordination du projet

Guillaume Dumenil (INSTITUT PASTEUR (BP))

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Monash university Structural Virology Laboratory
Heidelberg University Biochemie Zentrum Heidelberg
INSTITUT PASTEUR (BP)

Aide de l'ANR 259 382 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2016 - 36 Mois

Liens utiles

Explorez notre base de projets financés

 

 

L’ANR met à disposition ses jeux de données sur les projets, cliquez ici pour en savoir plus.

Inscrivez-vous à notre newsletter
pour recevoir nos actualités
S'inscrire à notre newsletter