Reconnaissance moléculaire et régulation en présence d’ARN d’un signal de localisation nucléaire bimodulaire – MOBILIS

Le projet vise à améliorer notre compréhension de la manière dont l'enzyme essentielle ADAR1 est reconnue par Trn1 afin d'être transportée vers le noyau et comment, au niveau moléculaire, ce phénomène est régulé par la présence d'ARN. Par une combinaison d'approches structurales et de biologie cellulaire, nous avons cherché à comprendre comment la liaison à l’ARN peut interférer avec l'importation nucléaire d'ADAR1 en perturbant l'interaction entre le dsRBD-NLS et Trn1. Tout d'abord, nous avons cherché à identifier les ARN cellulaires et/ou viraux naturels qui peuvent interférer avec l'importation nucléaire d'ADAR1. Nous avons cherché à isoler les ARN qui interagissent spécifiquement avec ADAR1 dans le compartiment cytoplasmique ou nucléaire, afin de comprendre quels ARN spécifiques sont impliqués dans la régulation du processus d'importation d'ADAR1. Ensuite, nous avons voulu caractériser structurellement l'interaction du dsRBD-NLS avec ses deux partenaires, à savoir Trn1 et les ARNs qui sont en compétition avec l'importation nucléaire médiée par Trn1. Les données structurales obtenues par cristallographie aux rayons X et les données de diffusion en solution (données SAXS) donnent une compréhension détaillée des mécanismes, au niveau moléculaire, de la régulation de la localisation d'ADAR1 via son NLS atypique sensible à la présence d'ARN.

Nos travaux ont permis d'identifier pour la première fois l'ensemble de l'éditome d'ADAR1, et ont montré que certains sites d'édition sont préférentiellement édités par les isoformes nucléaire et cytoplasmique d'ADAR1, à savoir ADAR1 p110 et ADAR1 p150. De plus, une majorité d'ARNs qui sont édités par ces deux isoformes changent lorsque la localisation de la protéine est modifiée. Nous avons également obtenu des informations structurales par cristallographie aux rayons X et SAXS qui ont permis de découvrir comment le dsRBD-NLS d'ADAR1 est activé et désactivé en présence d'ARN. Dans l'ensemble, nos données soutiennent un mécanisme d'exclusion stérique directe de Trn1 lorsque l'ARN est lié au dsRBD-NLS. Ainsi, notre travail met en lumière le mécanisme par lequel le NLS atypique d'ADAR1 peut être activé et désactivé, en fonction de la présence d'ARN associé au dsRBD.

D’autre part, nos travaux ont également permis de mettre en lumière un aspect très important de l’enzyme deaminase ADAR1. Nous avons en effet montré que le dsRBD atypique d’ADAR1 était responsable de la dimérisation de l’enzyme, et que cette dimérisation pouvait moduler l’efficacité et la sélectivité de l’éditing des ARNs.

Il est intéressant de noter que notre découverte — selon laquelle certains, mais pas tous, les sites d’édition sont affectés par la mutation de la surface de dimérisation du domaine dsRBD3 — suggère que la dimérisation n’est requise que pour l’édition efficace de certains sites spécifiques. Ce constat indique que la dimérisation exerce un impact variable selon les sites, ce qui ouvre la voie à une stratégie alternative : plutôt que de cibler l’activité catalytique d’ADAR1, l’inhibition de sa dimérisation pourrait constituer une approche pertinente pour moduler son activité d’édition dans un contexte d’immunothérapie.

Pour aller dans ce sens, il sera nécessaire de caractériser plus précisément les substrats affectés par la dimérisation du dsRBD3, en étudiant de manière approfondie l’effet des mutations de dimérisation sur l’édition à l’échelle du transcriptome. L’analyse de la position relative des sites d’édition impactés pourrait notamment fournir des informations précieuses sur l’organisation structurale des complexes entre ADAR1 et ses substrats.

Dans ce contexte, il est à noter qu’une périodicité dans la distribution des sites d’édition a déjà été proposée comme étant influencée par le mode de liaison des ADAR aux ARN cibles. Combinées à la détermination de la structure de la protéine ADAR1 dans sa forme complète, en complexe avec ses substrats ARN, ces données pourraient apporter des éléments de réponse aux questions encore ouvertes sur les mécanismes de sélection des sites d’édition par les ADAR.

Les phénomènes de transport entre le noyau et le cytoplasme à travers les pores nucléaires sont des mécanismes essentiels et hautement régulés dans les cellules eucaryotes. Les protéines, et les complexes multi-moléculaires sont reconnus par des récepteurs de transport appelés karyophérines. Les interactions entre les cargos et les récepteurs sont extrêmement spécifiques afin que seuls les complexes parfaitement constitués ne soient transportés d'un compartiment à l'autre.
La protéine Transportine-1 (Trn1) est un récepteur d'import nucléaire central dans la vie de la cellule. Elle est connue pour se lier aux signaux de localisation nucléaire (NLS) de type PY (pour proline-tyrosine). Cependant, de nombreux cargos pris en charge par la protéine Trn1 ne présentent pas de signal de type PY-NLS. Par exemple, l'enzyme humaine ADAR1 qui intervient dans les phénomènes d'édition des ARNs, ne possède pas de signal de localisation nucléaire de type PY. Nous avons récemment découvert qu'un domaine de liaison à l'ARN dans la protéine ADAR1 présente un signal de localisation nucléaire en deux module (signal de localisation bimodulaire). Cet arrangement particulier rend l'association entre Trn1 et le signal bimodulaire de ADAR1 sensible à la présence d'ARN.
Dans ce projet, nous avons pour but de caractériser les détails moléculaires de l'interaction entre Trn1 et le signal de localisation nucléaire de ADAR1 en utilisant une combinaison de méthodes biophysiques et structurales ainsi que des approches in vivo réalisées dans des cellules humaines. De plus, des ARNs viraux ou cellulaires naturels qui interagissent spécifiquement avec ADAR1 dans les compartiments nucléaire ou cytoplasmique seront isolés et testés afin de savoir si ceux-ci ont des propriétés de modulation des phénomènes de transport de ADAR1 entre le noyau et le cytoplasme. Nos études donneront accès à une compréhension détaillée des règles moléculaires qui régissent la reconnaissance de ce nouveau signal de localisation nucléaire non-linéaire par Trn1 et à une description fine de la façon dont cette reconnaissance est régulée par la présence d'ARN. De plus, notre étude éclaircira les diverses fonctions de la protéine ADAR1 qui intervient à la fois comme une enzyme de modification qui s'attaque aux infections virales, mais aussi comme une enzyme qui modifie des substrats ARN endogènes.