Développement d’un biocontrôle pour une réduction de la concentration de la toxine contaminante T2/HT2 dans le procédé de brasserie – TOXIFREE

Des méthodes biologiques et biochimiques sont mises en oeuvre.
Les cultures microbiologiques ont été réalisées sur milieu solide et liquide. Le milieu solide permet un screening rapide des souches de biocontrôle efficaces, tandis que le milieu liquide permet de mieux quantifier le(s) phénomène(s) d'interaction que ce soit en terme d'inhibition de la croissance du pathogène, ou de sa production de toxine T2. En liquide, des cultures séquentielles sont réalisées :préculture du biocontrôle G. candidum, puis élimination de la souche et mise en culture du/des pathogènes Fusarium spp dans le milieu préfermenté par G. candidum. sur son surnageant. Ces cultures séquentielles sont utilisées pour mettre en évidence certains mécanismes d'interaction, de comparer l'efficacité sur différents Fusarium (croissance et production de toxine) et les quantifier .
La chimie analytique permet de développer, améliorer les dosages des différents métabolites microbiens, que ce soit la toxine T2 comme les métabolites succeptibles d'intervenir dans l'interaction.
Par la suite, des méthodes de suivi de l'expression des gènes seront utilisées pour vérifier quels sont les gènes inhibés par le biocontrôle.

Un rapport bibliographique a été réalisé.
Les méthodes analytiques de dosage de différents métabolites ont été mise en place ou améliorées au sein de l'équipe de recherche.
La méthode d'inoculation a été standardisée en utilisant les spores de microorganismes.
Ceci a notamment permis d'obtenir des premiers résultats intéressants.
L’effet d’un métabolite potentiellement inhibiteur (littérature) a été validé par ajout de la molécule dans le milieu de culture de différentes espèces de Fusarium (achat de la molécule pure Sigma-Aldrich).
Ce métabolite semble présenter un effet sur la croissance et sur la production de la toxine par les espèces Fusarium testées.
Ce métabolite semble produit dans les premiers jours de culture de la levure (de 0h jusqu’à 72h) et disparait au fur et à mesure de la fermentation.

Des expériences ultérieures doivent être menées pour pouvoir cibler/préciser le moment et le pic de production du métabolite par Geotrichum. Ceci sera comparé à l'effet inhibiteur de Geotrichum sur Fusarium et voir si les effets sont corrélés. Ces résultats pourraient aider à l'optimisation de la mise en oeuvre du biocontrôle en brasserie.
Des essais seront ensuite réalisés pour étudier l'effet de ce métabolite sur l'expression des gènes impliqués dans la production de la toxine T2. POur cela, nous partirons de données sur la souche modèle Fusarium sporotrichoïdes pour laquelle les voies métaboliques de production de toxine T2 sont connues. Nous rechercherons si ces voies métabolique peuvent etre retrouvées chez Fusarium sporotrichoïdes (non connues à ce jour).
D'autres mécanismes d'interactions comme l'adsorption de la toxine seront étudiés (notamment via des isothermes de sorption)

Poster aux journées françaises mycotoxines Bordeaux (janvier 2018)

Dans un but de proposer un procédé sobre et efficient pour des aliments sains et salubres, TOXIFREE vise à développer et optimiser un biocontrôle innovant et respectueux de l’environnement, pour lutter contre des espèces de Fusarium, producteurs de mycotoxines T2/HT2. En Europe, l’implantation et l’expansion de Fusarium est devenu un problème sanitaire majeur pour toute la filière céréalière, dû à la dangerosité avérée pour la santé de ces toxines. La filière française orge-malt-bière, au poids économique important avec un positionnement au 5ème rang mondial pour la production de malt, est particulièrement concernée. En effet, les conditions opératoires lors du procédé de maltage sont favorables au développement des Fusarium, apportés par des grains d’orge contaminés au champ. En 2013 l’Union européenne a publié une recommandation sur des quantités maximales de T2/HT2 dans les céréales et produits dérivés (alimentation animale et humaine).
Le biocontrôle sera basé sur une approche préventive, grâce à la mise en œuvre d’une levure Geotrichum candidum. Les travaux consisteront à améliorer les connaissances sur le mécanisme d’action de G. candidum contre des espèces de Fusarium afin d’optimiser son utilisation pendant l’étape de maltage essentiellement.
Le projet proposé est organisé en deux parties.
La première est ciblée sur la compréhension de l’interaction indirecte entre G. candidum et des espèces de Fusarium. Elle se découpe en plusieurs tâches. Des tests préliminaires consisteront à répéter certaines expériences du projet Barsafe afin de vérifier que les mêmes phénomènes d’inhibition de F. langsethiae par G. candidum sont observés. Puis nous préciserons le mécanisme d’interaction indirect: inhibition de la transcription, de la traduction ou de l’excrétion des toxines. De plus, le biocontrôle sera évalué sur une autre espèce de Fusarium, également productrice de T2/HT2 : F. sporotrichioïdes. La comparaison des réponses des deux Fusarium devrait aider à comprendre le(s) phénomène(s) d’interaction afin d’optimiser la mise en œuvre du biocontrôle. Nous vérifierons également si d’autres phénomènes tels que l’adsorption ou la dégradation des mycotoxines par G. candidum peuvent avoir lieu, ainsi que des mécanismes d’interactions directes de contact. Une autre tâche vise à identifier l’agent actif produit par G. candidum. Différents métabolites inhibant la croissance de microorganismes ont été mis en évidence dans la littérature. Bien que dans notre cas, la croissance de F. langsethiae avait été peu affectée, alors que la production des toxines T2/HT2 l’était, nous rechercherons la présence de ces métabolites dans nos cultures de G. candidum, grâce à des méthodes de purification et analytiques disponibles au laboratoire.
La deuxième partie consiste à optimiser la mise en œuvre du biocontrôle à plusieurs échelles. Tout d’abord, nous chercherons à optimiser les conditions de culture de G. candidum dans un bioréacteur à l’échelle laboratoire afin d’améliorer la croissance de la levure ainsi que la productivité et le rendement de production de l’agent actif. Puis, nous validerons ces résultats à l’échelle pilote dans un contexte industriel, grâce à l’IFBM, qui nous fournira des contacts pour tester le biocontrôle lors du maltage. Dans ces essais, le développement de G candidum sera étudié, ainsi que la présence et le développement potentiel d’espèces de Fusarium (particulièrement F. langsethiae et F. sporotrichoïdes) et le niveau de T2/HT2.
Dans ce projet, les approches originale et complémentaire associent la biologie moléculaire, les fermentations, les études physiologique et microbienne. Le jeune chercheur bénéficiera de toutes les données et méthodologies issues du projet antérieur Barsafe, ainsi que de l’expérience de deux scientifiques experts. Ce contexte lui permettra d’avoir une base scientifique et humaine solide pour pouvoir rapidement coordonner ce projet, stoppé il y a 5 ans.