Bio-olfacticides: produire plus avec moins d'insecticides – DEMETER

Ce projet multidisciplinaire met en jeu une diversité d’approches : le séquençage haut-débit, la bioinformatique, la biologie moléculaire, l’édition du génome, l’électrophysiologie, l’apprentissage automatique ou machine learning, et l’étude du comportement. Des méthodes de séquençage modernes combinant Illumina et PacBio, associées à de puissant outils bioinformatiques, ont permis l’assemblage du génome de S. littoralis et l’annotation des OR de cette espèce. Leur analyse phylogénétique combinée à des approches de RNAseq (séquençage de transcriptomes) sur différents tissus, stades développementaux (chenilles/papillons) et sexes (mâles/femelles) a permis la sélection d’OR potentiellement importants dans des comportements clefs (récepteurs aux phéromones sexuelles, récepteurs aux odeurs de plantes). La caractérisation fonctionnelle de ces OR cibles (ie l’identification des odorants qu’ils reconnaissent) combine des approches de génomique fonctionnelle que nous avons mise au point sur cet insecte: expression hétérologue chez un insecte hôte ou in vitro, édition du génome de S. littoralis par CRISPR/Cas9 pour inactiver un OR in vivo. Des modèles de relation quantitative structure à activité (QSAR) sont appliqués sur les OR sélectionnés, et utilisés pour cribler virtuellement de grandes banques de données de molécules, prédisant de nouveaux ligands. Les prédictions sont soumises à l’expérimentation, en testant par électrophysiologie la réponse fonctionnelle des OR cibles aux ligands proposés. Si actifs, les nouveaux ligands sont testés sur le comportement olfactif des insectes.

Nous avons séquencé le premier génome complet de S. littoralis, ce qui nous a permis d’établir par annotation manuelle experte le répertoire complet d’OR de cette espèce (~80 OR). Nous y avons également identifié les récepteurs gustatifs, tout aussi importants que les OR pour la prise de décision alimentaire par les insectes, mettant en évidences des expansions très importantes (plus de 250 gènes) qui seraient liées au régime polyphage des herbivores.
Pour caractériser les OR les plus prometteurs en terme d’applications en protection des cultures, nous avons mené la première étude fonctionnelle d’envergure d’OR chez un insecte ravageur des cultures. Par cette approche systématique, et guidés par les analyses RNAseq et phylogénétiques, nous avons identifié les récepteurs à la phéromone sexuelle de cette espèce, cibles particulièrement pertinentes de « phérocides ». D’un point de vue évolutif, nous avons démontré que les récepteurs aux phéromones sexuelles des papillons de nuit sont apparus au moins deux fois au cours de l’évolution, révolutionnant l’idée couramment admise que les récepteurs phéromonaux ont une origine évolutive unique.
Notre crible fonctionnel a également permis d’identifier des récepteurs impliqués dans le comportement d’attraction olfactive des chenilles vers les plantes, sur lesquels nous avons construits et appliqué des modèles de prédictions computationnelle d’agonistes et/ou d’antagonistes. Des cribles in silico de banques virtuelles de molécules ont proposé de nouveaux ligands, dont l’action sur les OR et le comportement des insectes a ensuite été vérifiée expérimentalement. C’est la première fois qu’une telle combinaison de chimie-informatique et d’expérimentation est menée sur un Lépidoptère, et les taux de succès (30 à 90%) sont très prometteurs, démontrant concrètement l’efficacité de cette approche in silico pour identifier de nouveaux sémiochimiques actifs sur les insectes.

Les modèles in silico, alimentés par les données expérimentales, seront améliorés par « apprentissage », et seront également développés sur d’autres OR clefs de la noctuelle. Parmi les molécules confirmées comme actives sur les récepteurs et induisant un comportement recherché en biocontrôle (attraction, pour du piégeage par exemple ; répulsion), celles présentant les meilleurs potentialités d’exploitation (bon marché, non toxiques) seront sélectionnées pour des tests à plus grande échelle (e.g. en serre ou sur le terrain). A terme, une telle approche pourra s’étendre à d’autres ravageurs.
Il est à noter que pour les OR à spectre étroit, comme les récepteurs aux phéromones sexuelles, les prédictions ne sont pas efficaces car les modèles ne sont pas alimentés avec suffisamment de données. Une approche basée sur la structure de l’OR prendrait dans ce cas tout son sens. Les récents développements de la cryo-microscopie électronique ont permis la résolution à l‘échelle atomique des toutes premières structures tridimensionnelles d’OR d’insectes et l’identification des sites de liaisons aux odorants. La modélisation récepteur-ciblée viendra compléter les approches ligands ciblées mise en place dans ce projet, pour élargir l’éventail des bio-olfacticides.
Enfin, les récepteurs gustatifs ne sont pas en reste, et l’on peut tout aussi bien imaginer leur exploitation pour compléter la panoplie de bio-olfacticides par des « bio-gustaticides ».

Articles principaux

Caballero-Vidal G., Bouysset C., Grunig H., Fiorucci S., Montagné N., Golebiowski J., and Jacquin-Joly E. (2020) Machine learning decodes chemical features to identify novel agonists of a moth odorant receptor. Sci. Reports 10:1655.

Bastin-Héline L., de Fouchier A., Cao S., Koutroumpa F., Caballero-Vidal G., Robakiewicz S., Monsempes C., François M.C., Ribeyre T., de Cian A., Walker W.B., Wang G., Jacquin-Joly E. & Montagné N. (2019) A novel lineage of candidate pheromone receptors for sex communication in moths. eLife 8:e49826

Licon CC, Bosc G, Sabri M, Mantel M, Fournel A, Bushdid C, Golebiowski J, Robardet C, Plantevit M, Kaytoue M, Bensafi M (2019) Chemical features mining provides new descriptive structure-odor relationships. Plos Comput. Biol. 15(4):e1006945

de Fouchier A., Sun X., Caballero-Vidal G., Travaillard S., Jacquin-Joly E. & Montagné N. (2018) Behavioral effect of plant volatiles binding to Spodoptera littoralis larval odorant receptors. Front. Behav. Neurosci. 12: 264

Bushdid C., de March C.A., Matsunami H., Golebiowski J. (2018) Numerical Models and In Vitro Assays to Study Odorant Receptors. Methods in Molec. Biol. 1820:77-93

Bushdid C., de March C.A., Fiorucci S., Matsunami H., Golebiowski J. (2018) Agonists of G protein-coupled odorant receptors are predicted from chemical features. The J. Phys. Chem. Letters 9, 2235-2240

de Fouchier A., Walker W.B., Montagné N., Steiner C., Binyameen M., Schlyter F., Chertemps T., Maria A., François M.C., Monsempes C., Anderson P., Hansson B.S., Larsson M. C., Jacquin-Joly E. (2017) Functional evolution of Lepidoptera olfactory receptors revealed by deorphanization of a moth repertoire. Nature Comm. 8: 15709

Brevet

Jacquin-Joly E., de Fouchier A., Montagné N. (2018) “Pheromonal receptor of Spodoptera littoralis and identification of natural ligand of said receptor and uses thereof” INRA. n°16305329.1. Abandonné par l’INRAE en 2021 faute de partenariat industriel.

Contexte:
Les noctuelles comprennent des bioagresseurs parmi les plus dévastateurs. Nombre de comportements impliqués dans les ravages causés aux cultures (reproduction, reconnaissance et choix de la plante hôte et des sites de ponte,…) sont étroitement liés aux capacités olfactives de ces insectes. Cette modalité sensorielle apparait ainsi comme une cible privilégiée pour développer des stratégies innovantes de biocontrôle. Les acteurs clés impliqués dans la reconnaissance des signaux chimiques sont les récepteurs olfactifs (OR). Ces récepteurs apparaissent comme des cibles pertinentes pour la mise au point de méthodes de lutte sélectives et sans danger, de type « bio-olfacticides » : 1) ils sont complètement différents des OR de vertébrés, ce qui permet d’éviter des effets néfastes pour l’homme ou d’autres mammifères ; 2) ils sont très divergents entre insectes, ce qui permet d’agir de manière sélective et de préserver les insectes bénéfiques ; 3) ils présentent une structure à 7 domaines transmembranaires, semblable à celle des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), pour lesquels la pharmacologie a développé un savoir-faire unique pour le design d’agonistes ou d’antagonistes.

Objectifs:
Dans ce contexte, nous proposons de caractériser les ligands des OR de la noctuelle, Spodoptera littoralis, organisme modèle en protection des cultures, pour lequel un précédent projet a permis d’identifier un répertoire d’OR. Le séquençage du génome, en cours d’assemblage, permettra de le compléter. La mise au point d’une méthode innovante de crible haut-débit automatisé permettra l’identification d’un grand nombre de couples ligand(s)-récepteur (une première chez un ravageur). Cette avancée, importante dans le domaine des mécanismes moléculaires de l’olfaction, permettra d’identifier des OR clefs impliqués dans des comportements intéressants à cibler dans une stratégie de lutte (reproduction, oviposition, attraction, répulsion). Les données serviront de base pour des approches de modélisation ligand-ciblée et récepteur-ciblée. Elles permettront l’identification de potentiels agonistes/antagonistes/bloquants olfactifs –les « bio-olfacticides » - dont les effets sur les OR et in fine sur le comportement de l’insecte seront testés.

Méthodologie et résultats attendus:
Les outils classiques de bioinformatiques seront utilisés pour assembler le génome final et construire les séquences complètes des OR. La déorphanisation des OR de S. littoralis sera effectuée in vitro par expression dans des ovocytes de xénope et enregistrements par voltage-clamp. La caractérisation fonctionnelle (sensibilité de la réponse, spécificité, dynamique,…) bénéficiera d’outils « haut-débit » mis au point pour des études pharmacologiques sur les GPCR de mammifères, qui permettront de tester un nombre sans précédent de ligands naturels et synthétiques. Les résultats obtenus définiront le premier « espace odorant » d’un insecte ravageur, qui sera comparé avec ceux déjà établis chez la drosophile et le moustique. La modélisation moléculaire associée à la chimie-informatique sera utilisée pour prédire les bio-olfacticides, qui seront en retour testés pour leur efficacité sur les OR sur la plate-forme de crible haut débit, puis sur la physiologie antennaire et enfin sur le comportement des chenilles (compensateur de locomotion) et des adultes (tunnel de vol) en laboratoire. Au-delà d’une preuve de concept sur l’efficacité de stratégies «bio-olfacticides » en agriculture, ce projet proposera des molécules efficaces pour réduire les pertes agricoles tout en promouvant la sécurité alimentaire par la réduction de l’usage des pesticides.