Investigation du role de la retention d'intron dans la regulation de l'expression des genes. – WIRED

L'épissage alternatif affecte jusqu'à 95% des gènes chez l’homme. Il existe trois types principaux d'épissage alternatif: le saut d'exon, l’utilisation alternatif de sites en 5` ou 3` et la retention d’introns (RI). Alors que les deux premiers sont bien décrits dans le développement normal et la maladie, le rôle de l'IR dans ces processus reste à déterminer. La RI se produit quand un intron est inclus dans un ARNm mature. Generalement considéré comme un sous-produit de l'épissage défectueux, les transcrits avec RI sont rapidement dégradés par un mécanisme de surveillance appelle “nonsense-mediated decay”(NMD). Nous avons découvert que les granulocytes font usage de ce mécanisme pour inhiber des dizaines de gènes essentiels à leur différenciation (Cell, 2013). Nous avons ensuite trouvé un rôle crucial pour la RI dans la regulation des cellules souches pluripotentes (Nature, 2014) et dans la différenciation des érythrocytes (Blood, 2016). Parce que la RI ne pouvait auparavant être correctement identifié, de nombreuses études ont négligé des biomarqueurs potentiels et des cibles thérapeutiques liés à ce type de régulation des gènes. Une meilleure compréhension de la régulation par RI pourrait donc avoir un impact positif sur les recherches en cours et à venir dans de nombreux domaines qui contribuent à la santé humaine.
Dans cette proposition, nous allons étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent à la RI et développer des outils bioinformatiques pour permettre l’exploration de la RI a grande echelle. Le modèle que nous allons utiliser est celle de la différenciation granulocytaire de la souris. Ce modèle est idéal car les cellules peuvent être triées avec plus de 95% de pureté à chaque étape de differentiation et nous avons montré que la RI etait liée à des changements majeurs dans la morphologie granulocytaire.
Nous allons disséquer 2 mécanismes principaux qui causent la RI: les motifs qui agissent en cis pour reguler la RI et les modifications épigénétiques qui affectent le taux de transcription et en consequence la reconnaissance des introns par la machinerie d'épissage. Pour détecter précisément les motifs qui affectent la RI, nous allons d'abord développer une nouvelle approche pour identifier avec précision les événements de RI. Cette approche permettra de combiner une technologie de séquençage de troisième génération (PacBio) qui génère des séquences ultra-longues a partir de transcrits entiers avec le séquençage Illumina a haut débit. Une fois les evenements de RI detectés nous allons chercher des motifs d'ADN qui sont enrichies parmi les introns frequemment retenus et les tester en utilisant l’édition du génome par CRISPR-cas9 dans la lignée cellulaire MPRO. Nous utiliserons ensuite le même système pour supprimer ces motifs dans une greffe de la moelle osseuse de souris qui nous permettra d'observer comment ces cellules CRISPR-cas9 modifiés, dans lesquelles ces motifs ont été supprimés affecte la repopulation granulocytaire in vivo . Nous allons ensuite nous concentrer sur les changements épigénétiques qui peuvent moduler la RI. La méthylation de l'ADN et la position des nucléosomes peuvent interagir avec les protéines MeCP2 et CTCF pour moduler la vitesse de transcription de polII et affecter l’épissage de l'ARNm. En évaluant ces marques épigénétiques, les sites de fixation de MeCP2 et CTCF et l'identification précise de la RI, nous serons en mesure de découvrir des associations entre les marques épigénétiques et la RI. Nous allons ensuite tester cette association avec une perte de fonction de MeCP2 et CTCF et en modifiant la methylation aux sites associes avec la RI en utilisant un TALE-Tet1 et dCas9-DNMTA3.
Ce projet permettra de développer des méthodes pour la détection de RI avec précision et nous permettra de déchiffrer les mécanismes moléculaires de ce nouveau mode de régulation des gènes qui a jusqu'ici été liée à de nombreuses pathologies et processus de différenciation normales.