Les MOllusques BIvalves comme inDICateurs de la contamination des masses d’eau par les protozoaires parasites. – MOBIDIC

La démarche utilisée dans le projet porte sur trois axes complémentaires :
- Améliorer l’extraction et la détection des protozoaires en matrices complexes (bivalves). Différents paramètres visant la préparation des matrices, l’élution/concentration des parasites à partir des matrices et l’extraction/purification des ADN de parasites ont été testés. Concernant la détection et la quantification, différentes approches moléculaires (qPCR, dd-PCR ou encore LAMP) ont été développées et comparées
- Définir la représentativité de la charge en protozoaires mesurée dans les bivalves vis-à-vis du niveau de contamination des masses d’eau. Ce volet est abordé par l’étude des cinétiques d’accumulation et de dépuration des trois protozoaires en conditions contrôlées de laboratoire en exposition simple pendant 21 jours suivi de 21 jours de dépuration en eau claire. Une deuxième expérimentation a été effectuée mais cette fois-ci en exposition simultanée des 3 protozoaires durant 7 jours suivi de 7 jours de dépuration.
- Améliorer nos connaissances sur les effets possibles de ces protozoaires sur la physiologie des bivalves. Une attention particulière a été portée sur le compartiment hémolymphatique incluant les cellules en charge de la défense immunitaire des mollusques. Etant donné l’absence d’information dans la littérature, nous avons choisi, sur la base d’exposition ex vivo, de développer d’une part une approche ciblée (marqueurs de cytotoxicité, phagocytose, d’apoptose, de nécrose…) et d’autre part une approche ouverte de protéogénomique afin d’identifier les modes d’action.

Les résultats les plus marquants de cette période concernent la mise en place de quatre nouveaux protocoles pour extraire et détecter les trois protozoaires dans les tissus et l’hémolymphe de la dreissène et la moule bleue. Outre leurs performances nettement supérieures à ceux de référence, la simplification de la procédure et la réduction du temps de traitement sur les tissus (notamment de moule bleue), constituent une réelle avancée et rupture par rapport aux méthodes existantes. La faisabilité et l’intérêt de la ddPCR pour la quantification des parasites a également été démontrée. Concernant la cinétique d’accumulation et de dépuration, les expositions en laboratoire ont montré que les 2 espèces de bivalves sont capables de bioaccumuler les 3 protozoaires de façon dose et temps dépendant, que ce soit en exposition simple ou simultanée. Concernant les réponses biologiques, le projet a permis l’acquisition de nouvelles connaissances vis-à-vis de marqueurs mis au point chez les hémocytes de dreissènes par des mesures en cytométrie et en dd-PCR. En complément de l’approche ciblée (période 1), l’approche protéomique a permis d’identifier de nombreuses protéines (671) modulées par C. parvum, ce qui permettra i) de préciser plus finement le mode d’action du protozoaire sur les hémocytes de dreissènes, et ii) identifier de potentiels biomarqueurs d’effet.

Le projet MOBIDIC concernait initialement exclusivement des approches en conditions contrôlées de laboratoire. Une évolution du WP2 est proposée et concernera l’application des nouveaux protocoles d’extraction et quantification des protozoaires dans les mollusques pour évaluer in situ la qualité des masses d’eau. Concernant la dreissène, cette approche bénéficiera d’échantillons prélevés dans différents projets en cours (ZA PIREN-Seine, Projet EQUAL AERM et INTERREG FWVL DIADeM). De plus, suite à l’approche comparative de protéomique, une centaine de protéines d’intérêt seront sélectionnées pour une détection et de quantification de façon simultanée en spectrométrie de masse.
La mise en place de protocoles performants pour la détection des parasites dans les deux espèces de bivalves ouvre des perspectives dans les domaines environnemental et également alimentaire. Ils permettront notamment de mieux caractériser l’exposition de l’homme à ces dangers émergents, par exemple dans le cadre de plans de surveillance.

Le projet, démarré depuis moins de 36 mois, est encore dans sa phase expérimentale et d’acquisition des données. Le projet fait l’objet actuellement de plusieurs communications, de deux chapitres d’ouvrage et de deux articles soumis ou en cours de soumission

Les protozoaires Cryptosporidium spp, Giardia duodenalis et Toxoplasma gondii pour lesquels l'eau constitue une voie de transmission importante sont identifiés comme des priorités de santé publique. Le suivi de la contamination en protozoaires des milieux aquatiques via une détection par immunofluorescence (IF), excepté pour T. gondii, dans l’eau présente plusieurs limites techniques ainsi qu’une variabilité des résultats liée aux paramètres physico-chimiques et météorologiques, ce qui est particulièrement important dans un contexte de changement global. L’accumulation de ces protozoaires au sein d’invertébrés représente une alternative de choix comme outil d’évaluation de la contamination des eaux et présente une rupture vis-à-vis des approches actuelles de recherche de protozoaires en tant qu’indicateurs de la contamination de l’eau. Les avantages portent sur le caractère intégrateur (temporel) de la charge corporelle en pathogènes et la représentativité de la mesure vis-à-vis du site d’exposition (animaux fixés). Afin de disposer d’outils applicables à grande échelle spatiale, deux espèces de moules seront considérées : une côtière, la moule bleue (Mytilus edulis) et une continentale, la moule zébrée (Dreissena polymorpha). L’utilisation de la capacité d’accumulation de ces parasites par nos espèces sentinelles en tant qu’outil nécessite de lever différents verrous scientifiques comme autant de questions scientifiques organisées autour de trois tâches. 1- Il est nécessaire de développer une méthode sensible pour la détection et la quantification simultanées des (oo)cystes des protozoaires dans une matrice complexe (tissus d’invertébrés). MOBIDIC propose de développer des approches moléculaires innovantes rapides et sensibles. 2- Il est nécessaire de valider la représentativité de la charge parasitaire mesurée au sein des tissus mous des invertébrés vis-à-vis du degré de contamination des masses d’eau. Pour ceci il est proposé de définir les cinétiques d’accumulation des différents pathogènes chez les moules, durant des expositions simples ou combinées en conditions contrôlées. 3- La physiologie des moules, sous l’influence d’un grand nombre de facteurs endogènes et environnementaux, peut moduler leur capacités d’accumulation des pathogènes. Ainsi le projet se propose d’appréhender l’influence de paramètres environnementaux sur la capacité d’accumulation des pathogènes par les moules. De façon complémentaire, et étant donné le peu de données dans la littérature, il sera également investigué l’influence possible des protozoaires sur la physiologie des moules et tout particulièrement sur des réponses liées à l’immunité. MOBIDIC se propose d’apporter des connaissances nouvelles sur les interactions entre des protozoaires et les moules dans le but de définir un indicateur fiable de la qualité biologique des masses d’eau dans un souci de préservation de la qualité des ressources et de protection des populations humaines. MOBIDIC produira également des données originales en écotoxicologie sur les effets cumulatifs/interactions entre les contaminants chimique et biologique en lien avec une meilleur compréhension des risques associés aux changements climatiques. Pour atteindre les objectifs, un consortium pluridisciplinaire a été mis en place, associant d’une part des compétences en sciences de l’environnement (écotoxicologie) et de santé humaine (parasitologie) mais également d’autre part des partenaires académiques, institutionnel et privé afin de concilier recherche cognitive et appliquée dans un objectif de transfert de ces compétences aux gestionnaires et utilisateurs des masses d’eau. Ceci est en cohérence avec les priorités issues de la « Stratégie Nationale de Recherche ». Pour faciliter ce transfert, une demande de labellisation du projet a été faite au pôle de compétitivité Hydreos, et différentes sociétés membres de ce pôle participeront au comité de pilotage du projet.