Metabolome de deux contaminants fongiques du blé d'importance majeure: identification de nouveaux métabolites toxiques – Newmyco

Depuis le lancement du projet, nos travaux ont essentiellement visé à: - produire des grains marqués et déterminer les conditions de réalisation d'un tel double marquage isotopique pendant l'infestation par F. graminearum - caractériser le métabolome de Penicillium verrucosum lors de son développement sur des grains - Evaluer la profondeur d’analyse nécessaire pour la caractérisation du transcriptome fongique in planta

Un certain nombre d’essais préliminaires ont ainsi été réalisé en partenariat étroit entre l’INRA Clermont et le CEA pour définir les conditions optimales de culture en enceinte confinée. En effet, la culture en enceinte confinée en vue du double marquage isotopique de plants infestés par Fusarium graminearum s’est révélée plus complexe qu’attendue. En effet, l’infection fongique entraîne une réduction considérable du poids des grains et, compte tenu des contraintes de place dans les enceintes et de consommation de gaz, limite fortement le poids du matériel biologique disponible en fin d’essai. plusieurs essais ont dû être réalisés pour tester différentes variétés de blé et optimiser au maximum l’utilisation des chambres de marquage. Un premier marquage 50% 13C et 100% N15 a été réalisé avec succès. Depuis le début du projet, les travaux menés ont permis de caractériser le métabolome de P. verrucosum. Les extraits des cultures réalisés sur grains marqués ont été analysés par spectrométrie de masse haute résolution. Grâce au marquage isotopique, les métabolites secondaires ont été spécifiquement détectés et leurs formules brutes ont été caractérisées. Puis la caractérisation de nouveaux métabolites secondaires a été assistée par la génération de réseaux moléculaires de similarités MS/MS. L’étude de P. verrucosum a permis de détecter 98 métabolites secondaires. Parmi eux, 80% sont inconnus selon les bases de données actuelles. La génération de réseaux moléculaires à partir du métabolome secondaire a permis de mettre en évidence un groupe de 25 composés se comportant de manière similaire en spectrométrie de masse. Seize de ces composés ont été identifiés comme étant des dérivés de fungisporines, des métabolites suspectés d’intervenir dans la croissance aérienne des champignons. Ces travaux ont fait l'objet d'une publication et de plusieurs présentation dans des congrès internationaux et nationaux.

Dans les mois qui viennent, le métabolome de F. graminearium va être caractériser, en utilisant une culture sur grains marqués (comme il a été fait avec P. verrucosum) mais aussi en utilisant des graisn marqués pendant l'infestation fongique afin d'analyser le metabolome in planta. En parallèle, les essais visant à) étudier l'impact variétal sur le métabolome fongique vont débuter, un certain nombre d'échantillon de terrain ayant déjà été collectée par le partenaire industriel du projet.

1 publication publiée (Hautbergue T., et al. Evidencing 98 secondary metabolites of Penicillium verrucosum using substrate isotopic labeling and high resolution mass spectrometry. Chromatogr B analyt Technol Biomed Life Sci, 2017, doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.03.011) 1 publication soumise 4 communication à des congrès scientifiques 2 articles de vulgarisation scientifique 1 présentation dans le cadre de «ma thèse en 180 secondes«, Mlle Hautbergue ayant été finaliste nationale.

Les moisissures sont des contaminants fréquents des céréales produites dans le monde et particulièrement du blé, production la plus importante pour la consommation humaine en Europe. En fonction des conditions environnementales et de leurs particularités physiologiques, ces micro-organismes peuvent se développer sur les plantes vivantes, au champ ou en période péri-récolte mais aussi pendant le stockage, en cas de mauvais séchage ou de réhumidification des grains.
Un tel développement peut entraîner l’apparition de pathologies sur la plante et décroitre les rendements de production. Il peut modifier les qualités organoleptiques et nutritionnelles des grains récoltés, altérer leurs qualités technologiques et aussi entraîner l’accumulation de composés toxiques appelés mycotoxines. Le métabolisme secondaire fongique est très actif mais malheureusement mal connu puisqu'il est admis que seul 20% des métabolites secondaires des espèces les plus étudiées sont caractérisés.
Dans ce contexte, l’objectif principal du projet est d’identifier de nouveaux métabolites toxiques pouvant être produits par deux espèces fongiques majeures: Fusarium graminearum qui contamine le blé au champ et Penicillium verrucosum qui est le principal contaminant au cours du stockage. Pour cela, le métabolome complet de ces deux espèces sera caractérisé en utilisant, dans un premier temps, une nouvelle stratégie analytique basée sur la comparaison par spectrométrie de masse haute résolution des métabolites secondaires produits par les champignons d’intérêt lors de leur croissance sur des grains enrichis en isotopes stables spécifiques. Les nouveaux métabolites seront purifiés et leur structure et leur toxicité étudiée.
Les enquêtes mondiales montrent que les mycotoxines sont des contaminants très fréquents des céréales, retrouvées dans environ 70% des échantillons mais à des niveaux variables en fonction des conditions climatiques et des pratiques agricoles. A l'échelle européenne, seuls quelques mycotoxines font l'objet de réglementations en alimentation humaine et animale.
Il est certain que, outre les mycotoxines bien caractérisées, d'autres composés d'origine fongique encore inconnus peuvent contaminer le blé. De plus, les progrès des méthodes analytiques développées pour l’analyse des mycotoxines permettent de soulever d’importantes questions vis à vis de ces contaminants :
- une partie des toxines est conjuguée à des constituants de la plante et n’est pas détectées directement lors d'analyse.
- d’autres composés sont produits simultanément avec les toxines réglementées. Parmi ces molécules, certaines ont une toxicité égale où supérieure à celle des toxines faisant l’objet de valeurs seuils.
Ces données soulignent que le métabolisme secondaire des moisissures conduisant à la contamination mycotoxique des céréales reste mal connu.
Les objectifs spécifiques du projet seront de:
- caractériser le métabolome secondaire de Fusarium graminearum pendant l'infection des plants et grains de blé
- caractériser le métabolome secondaire de Penicillium verrucosum pendant la contamination des grains
- comparer l'impact de la résistance variétale sur le métabolisme secondaire
- identifier les nouvelles mycotoxines parmi les métabolites principaux caractérisés.

Pour cela, le projet bénéficiera de l’expertise de :
- Deux équipes de recherche INRA, spécialisées dans le métabolisme et la toxinogénèse fongique (Equipe Biosynthèse et toxicité des mycotoxines, UMR INRA-INPT Toxalim) ainsi que dans la réponse des plantes aux attaques fongiques (Equipe Maladies des céréales, UMR INRA 1095, Clermont-Ferrand)
- Un partenaire industriel (Syngenta France), spécialisé dans la sélection de nouvelles variétés de blé
- Une plateforme analytique dédiée aux analyses de contaminants à l’état de traces (plateforme MetaToul-AXIOM, UMR 1331 INRA-INPT Toxalim)
- Des compétences du CEA Cadarache, qui sera en charge de la production des plans et grains marqués par des isotopes stables.